Praktikum-BH-1

биуретового комплекса белка.

Порядок выполнения работы.

III.2.Контрольные вопросы.

Какие факторы удерживают белки в растворе?

Чем обусловлен коллоидный характер белковых растворов? На чем основаны реакции осаждения белков?

Какие физико-химические свойства белков позволяют их фракционировать?

Что такое высаливание?

С помощью какой реакции можно выявить белок в растворе?

11

Какую окраску имеют белковые и безбелковые растворы при проведении биуретовой реакции?

Какие отдельные аминокислоты могут дать положительную биуретовую реакцию? Чем отличаются альбумины и глобулины?

Материал для самоподготовки. I а)1. с.19-49, II, III.

Занятие № 2

ТЕМА. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ. МЕТОДЫ ОЧИСТКИ БЕЛКОВ

Цель занятия: 1.Изучить структурную организацию белковой молекулы как основу функционирования всех белков. 2.Ознакомиться с особенностями структуры фибриллярных

белков.

3.Освоить методы очистки белков от примесей на примере диализа.

Исходный уровень знаний:

-аминокислоты: строение, классификация;

-ковалентные и нековалентные связи: характеристика, примеры;

-физико-химические свойства белков.

Содержание занятия.

I.2. Строение глобулярных белков (первичная, вторичная, третичная, четвертичная структуры).

Особенности строения молекулы фибриллярных белков. Взаимосвязь структуры и функции белков.

Видовая специфичность первичной структуры и антигенные свойства белков.

Методы очистки белков (хроматография, электрофорез, диализ и др.).

Гидролиз белка (виды, условия, продукты полного и неполного гидролиза).

II.1. Работа: ДИАЛИЗ БЕЛКА

12

Принцип метода.

Диализ основан на способности полупроницаемых мембран пропускать сквозь поры низкомолекулярные вещества и задерживать высокомолекулярные коллоидные частицы. Ди-

ализ является удобным методом очистки белков. При диализе коллоидный раствор помещают в коллодиевый или целлофановый мешочек и погружают в дистиллированную или водопроводную воду. Молекулы солей, сахаров и других низкомолекулярных веществ легко диффундируют через мембраны, а вещества коллоидной природы остаются в мешочке.

3

Рис. 1. Варианты устройства системы для диализа белка.

А) диализатор из стеклянного цилиндра с дном из полупроницаемой мембраны. Б) диализатор из коллодиевого мешочка. 1-держатель, 2- диализуемый раствор, 3-диализат.

Порядок выполнения работы.

В коллодиевый мешочек (диализатор) налить 5 мл солевого раствора белка. Погрузить в стакан с дистиллированной водой на 1 час. Через час с небольшими порциями диализата (наружная жидкость) проделать реакции на хлориды и белок и убедиться в том, что минеральные соли продиффундировали во внешний сосуд, а белок остался в содержимом мешочка.

Проба на белок (биуретовая реакция).

13

III.2. Контрольные вопросы. Что такое диализ?

Что такое диализат и диализуемая жидкость?

Какие реакции используются для контроля диализа? Как используется диализ в медицине?

Материал для самоподготовки. I а)1. с.26-32, 49-71; II; III.

Занятие № 3

ТЕМА. КЛАССИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ. ХИМИЯ ПРОСТЫХ И СЛОЖНЫХ БЕЛКОВ. МЕТОДЫ ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКОВ

Цель занятия: 1.Ознакомиться с классификацией белков, характеристиками отдельных групп белков и пептидов. 2.Освоить методы осаждения белков.

Исходный уровень знаний:

- строение и свойства белков;

14

- биологическая роль белков. Содержание занятия.

I.2. Характеристика основных групп простых белков. Принцип классификации сложных белков. Характеристика природных пептидов.

Содержание белков и аминокислот в крови в норме и при патологии.

I.3. Контрольная работа.

СВОДНЫЕ ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ ПО РАЗДЕЛУ "СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА БЕЛКОВ"

1.Определение класса белков. Элементарный состав, наименьшая структурная единица, молекулярная масса белков.

2.Классификация аминокислот, входящих в состав белков, основанная на полярности радикалов; примеры неполярных, полярных, положительно- и отрицательно заряженных аминокислот.

3.Амфотерность и растворимость аминокислот. Функциональные группы аминокислот, участвующие в образовании ковалентных, ионных, электростатических и гидрофобных (Ван- дер-Ваальса) связей белковой молекулы.

4.Структура и название аминокислот, производных пропионовой, масляной, валериановой, капроновой, янтарной и глутаровой кислот.

5.Структура и название окси- и серусодержащих, гомо- и гетероциклических аминокислот.

6.Факторы, удерживающие белок в растворе. Изоэлектрическая точка белков. Методы осаждения белков, значение для медицины. Обратимое и необратимое осаждение. Примеры.

7.Основные физико-химические свойства белков. Свойства коллоидных растворов, отличительные от свойств истинных растворов. Методы выделения и очистки белков. Диализ, значение для медицины.

8.Методы обнаружения белков в растворе и изучения качественного состава белка. Гидролиз белка, виды гидролиза, промежуточные и конечные продукты. Применение белковых

15

гидролизатов в лечебной практике.

9. Назовите трипептид, например:

H3C-CH-CH2-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-COOH

CH2NH2

10. Напишите трипептид: а) глицил-валил-изолейцин; б) лейцил-тирозил-гистидин; в) аланил-метионил-триптофан и т.п.

11.Белки - основа жизненных процессов. Значение работ А.Я.Данилевского, Э.Фишера, Л.Полинга в формировании представлений о строении белков. Уровни структурной организации белковой молекулы.

12.Первичная структура, формирующие её связи. Зависимость биологических свойств белков от характера аминокислотной последовательности в полипептидной цепи ( HbA, HbS ).

13.Конформация пептидных цепей в белках: вторичная и третичная структуры, связи, определяющие эти структуры. Обратимая и необратимая денатурация белков; причины, значение.

14.Высшая форма организации белковой молекулы - четвертичная структура. Кооперативные изменения конформации протомеров (на примере гемоглобина и миоглобина).

15.Зависимость функциональных свойств белков от их конформации. Способность к специфическим взаимодействиям ("узнавание") как основа функционирования всех белков. Антигенные свойства белков.

16.Биологические функции белков. Различия белкового состава органов. Изменение белкового состава при онтогенезе и

16

болезнях.

17.Классификация белков. Химия сложных белков. Важнейшие представители простых и сложных белков в организме человека.

18.Структурные белки. Классификация, особенности строения, распределение в тканях. Самосборка многомолекулярных белковых структур на примере коллагеновых волокон.

II.1. Работа № 1. ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ ПРИ КИПЯЧЕНИИ Принцип метода основан на денатурации большинства белков при нагревании их растворов при температуре свыше

5О-6О0С, что приводит к потере растворимости, особенно в изоэлектрической точке.

Почти все белки свертываются и осаждаются при нагревании в нейтральной и слабокислой среде. В сильнокислых и щелочных средах растворы белков при кипячении денатурируют, но не коагулируют и могут дать осадок лишь при добавлении достаточного количества какой-либо нейтральной соли (NaCl, сернокислый аммоний и др.). Устойчивость белка в растворе зависит от приобретения (+) заряда в случае сильнокислой среды и усиления (-) заряда в щелочной среде.

При понижении рН диссоциация карбоксильной группы подавляется и молекула становится положительно заряженной. При повышении pH происходит отрыв связанного протона аминокислоты и молекула приобретает отрицательный заряд. Более полное и быстрое осаждение происходит при достижении изоэлектрической точки. Изоэлектрической точкой называют такое значение рН, при котором суммарный электрический заряд белка равен нулю и, следовательно, белок при этом в электрическом поле теряет подвижность, т.е. остается на старте. Для

17

большинства белков изоэлектрическая точка соответствует слабокислой среде (в пределах от 5,5 до 6,9).

Итак, важную роль в денатурации белков при нагревании играет концентрация водородных ионов, т.е. определенная реакция среды, и присутствие солей.

Порядок выполнения работы:

Работа № 2a. ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ СОЛЯМИ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ

Принцип метода.

Осаждение белков солями тяжелых металлов в отличие от высаливания происходит при небольших концентрациях солей.

Белки при взаимодействии с солями тяжелых металлов (свинца, меди, серебра, ртути и др.) адсорбируют их, образуя солеобразные и комплексные соединения, растворимые в избытке этих солей (за исключением солей AgNO3, HgCl2), но нерастворимые в воде.

18

Растворение осадка в избытке солей называется адсорбционной пептизацией. Данное явление происходит вследствие возникновения одноименного (+) заряда на частицах белка. Способность белка прочно связывать ионы тяжелых металлов в виде нерастворимых осадков в воде используется как противоядие при отравлении солями ртути, меди, свинца и др. Обычно применяют белки молока и яиц сразу после отравления, пока эти соли еще находятся в желудке и не успели всосаться. Вслед за введением белка у больного вызывают рвоту, чтобы удалить остатки яда из организма.

Порядок выполнения работы.

Работа № 2б. ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ КОНЦЕНТРИРОВАННЫМИ МИНЕРАЛЬНЫМИ КИСЛОТАМИ

Принцип метода.

Концентрированные минеральные кислоты вызывают денатурацию белка и образуют комплексные соли белка с кислотами. В избытке всех минеральных кислот, за исключением азотной, выпавший осадок белка растворяется. Качественная реакция с концентрированной HNО3 лежит в основе количественного определения белка в моче по методу Робертса-Столь-

19

никова-Брендберга.

Порядок выполнения работы:

Примечание: Раствор белка осторожно наслоить на кислоту по стенке пробирки, наклоненной под углом 450.

РЕЗУЛЬТАТЫ:

ВЫВОД:

1

2

Рис. 2. Наслаивание пробы на концентрированную кислоту:

1 -раствор белка; 2-кислота.

III.2. Контрольные вопросы.

Какие факторы удерживают белки в растворе? Чем обусловлена реакция осаждения белков? Что такое коагуляция белков? Виды коагуляции. Что такое денатурация белка? Виды денатурации. При каких условиях происходит: коагуляция

20