Praktikum-BH-1

Порядок выполнения работы:

Работа № 2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АМИЛАЗЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ Принцип метода.

Метод определения амилазы основан на определении остатка нерасщепленного крахмала и промежуточных продуктов его гидролиза (декстринов). У здорового человека из переварившегося под влиянием амилазы крахмала образуется 25-40 мг глюкозы. Амилаза (диастаза) сыворотки крови значительно активируется при таких заболеваниях как сахарный диабет, болезни поджелудочной железы, инфекционный паротит и некоторых других.

Порядок выполнения работы:

Свежую сыворотку крови в объеме 0,1 мл (набрать микропипеткой) нагреть в закрытой пробкой пробирке в термостате при 380С в течение 1-2 минут. Затем добавить 0,25 мл 0,1% раствора крахмала и вновь поместить в термостат при той же температуре на 15 минут, периодически встряхивая. После инкуба-

31

ции капнуть 0,025 N раствор йода и отметить окраску. Количество глюкозы, соответствующее количеству расщепленного крахмала, найти по следующей таблице:

ВЫВОД:

III.2. Контрольные вопросы.

Укажите роль активаторов и ингибиторов ферментативной реакции.

Какие вещества могут выступать в роли активаторов и ингибиторов ферментов?

Указать нормальное содержание амилазы в крови челове-

ка.

Укажите клиническое значение определения диастазы сыворотки крови.

Что является ингибитором амилазы слюны? Что является активатором амилазы слюны?

Материал для самоподготовки: I а)1. с.152-168, 579-580; II; III.

Занятие № 7

КОЛЛОКВИУМ ПО РАЗДЕЛУ "ФЕРМЕНТЫ"

32

Вопросы к коллоквиуму

1.История открытия и изучения ферментов. Значение работ Л.Пастера, М.М.Манассеиной, Э.Бюхнера, Д.Самнера в установлении природы ферментов.

2.Сходство (различие) ферментов и неорганических катализаторов.

3.Общая характеристика ферментов. Биологическая роль ферментов и место энзимологии в биологии и медицине.

4.Химическая природа ферментов. Простые и сложные ферменты.

5.Строение ферментов. Понятие об активном и аллостерическом центрах.

6.Понятие о кофакторах, коферментах и простетических группах. Химическое строение и функции коферментов.

7.Изоферменты как пример биохимического полимор-

физма.

8.Мультимолекулярные ферментные системы. Иммобилизованные ферменты.

9.Основы ферментативной кинетики. Константа Миха-

элиса.

10.Зависимость активности ферментов от температуры. Как выявить в эксперименте термолабильность ферментов?

11.Зависимость активности ферментов от рН. Как выявить эту зависимость в эксперименте?

12.Зависимость скорости реакции от концентрации фермента и субстрата.

13.Специфичность действия ферментов. Комплементарность структуры субстрата и активного центра фермента. Виды специфичности ферментов.

14.Строение аллостерических ферментов. Аллостерический переход.

15.Теории действия ферментов как биологических катализаторов.

16.Современная теория ферментативного катализа. Представления о механизме действия ферментов.

17.Полифункциональный катализ. Кислотно-основной

33

(электрофильно-нуклеофильный) катализ.

18.Регуляция активности действия ферментов.

19.Активирование ферментов. Виды активирования. Проферменты.

20.Ингибирование ферментов. Обратимые, необратимые

иконкурентные ингибиторы. Применение ингибиторов в качестве лекарств.

21.Принципы количественного определения ферментов. Единицы активности и количества ферментов. Измерение активности ферментов с диагностической целью.

22.Энзимопатии: наследственные (первичные), вторичные. Нарушения обмена при алкаптонурии, фенилкетонурии, гипераммониемии и др.

23.Различия ферментного состава органов и тканей. Органоспецифические ферменты. Ферменты плазмы крови. (Изменение ферментного состава при онтогенезе).

24.Классификация и номенклатура ферментов.

25.Понятие об энзимодиагностике и энзимотерапии.

РАЗДЕЛ III. ВИТАМИНЫ

Занятие № 8

ТЕМА. КЛАССИФИКАЦИЯ, СТРУКТУРА И БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ВИТАМИНОВ. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНОВ

Цель занятия: Уяснить роль витаминов в метаболизме, их классификацию, характеристику представителей каждого класса витаминов.

Исходный уровень знаний:

-общие понятия о витаминах, их биологическом значении;

-симптомы некоторых гиповитаминозов;

-пути поступления в организм.

Содержание занятия. I.3. Контрольная работа.

34

СВОДНЫЕ ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ ПО РАЗДЕЛУ "ВИТАМИНЫ"

1.История изучения витаминов. Вклад отечественных

ученых.

2.Определение класса "Витамины", функции витаминов, их участие в метаболизме.

3.Классификация витаминов, буквенные обозначения, эмпирические названия.

4.Жирорастворимые витамины: биологическая роль, источники, формулы витаминов А и D3.

5.Водорастворимые витамины: биологическая роль, источники; формулы витаминов В1, В2, В3, В6, РР, Н, С.

6.Витаминоподобные вещества: названия, биологическая роль; формулы липоевой кислоты, холина, инозита, KoQ, парааминобензойной кислоты.

7.Понятие об алиментарных и вторичных авитаминозах, гипо- и гипервитаминозы.

8.Причины развития гиповитаминозов.

9.Заболевания, связанные с избытком, недостатком или отсутствием витаминов в организме. Укажите их основные симптомы.

10.Коферментные функции витаминов; формулы НАД (НАДФ), ФАД (ФМН), ПФ, ТДФ.

11.Понятие об антивитаминах и механизм их действия.

12.Структурные аналоги витаминов - лекарственные средства, область их применения.

13.Провитамины. Провитамин А.

14.Определение веществ по формуле. Например:

35

II.1. Работа № 1. КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА ВИТАМИН В2

Рибофлавин входит в состав простетической группы флавиновых ферментов - флавопротеидов в виде коферментов флавинадениндинуклеотида (ФАД) и флавинмононуклеотида (ФМН). Флавопротеиды участвуют в реакции дегидрирования, т.е. отщепления электронов и протонов от субстрата. Они участвуют в окислении НАД*Н (Н+) в цепи биологического окисления -аминокислот, -кетокислот и других субстратов.

Принцип метода и химизм реакции.

Окисленная форма витамина В2 представляет собой желтое флюоресцирующее в ультрафиолетовых лучах вещест-

во. Реакция на витамин В2 основана на его способности легко восстанавливаться. При этом раствор витамина В2, обладающий желтой окраской, приобретает сначала розовый цвет за счет образования промежуточных соединений, а затем обесцвечивается, т.к. восстановленная форма витамина В2 бесцветна.

Порядок выполнения работы:

К 10 каплям раствора витамина В2 добавить 5 капель концентрированной хлористо-водородной кислоты и опустить зёрнышко металлического цинка.

Результат:

36

Работа № 2. КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА ВИТАМИН РР

Витамин РР входит в состав коферментов пиридинзависимых ферментов: никотинамидадениндинуклеотида - НАД+ и никотинамидадениндинуклеотидфосфата - НАДФ+. Эти коферменты входят в состав дегидрогеназ и участвуют во многих окислительно-восстановительных реакциях. Отсутствие витамина РР в пище вызывает пеллагру.

Принцип метода.

Витамин РР при нагревании с раствором ацетата меди образует синий плохо растворимый осадок медной соли

никотиновой кислоты.

Порядок выполнения работы:

Перед определением 3% раствор витамина РР следует обязательно взболтать. Затем набрать 20 капель его и нагреть до кипения; при этом мутный раствор становится прозрачным. Прилить, предварительно взболтав, 20 капель 5% раствора ацетата меди к нагретому раствору витамина РР. Затем содержимое пробирки довести до кипения и сразу охладить под струёй холодной воды.

РЕЗУЛЬТАТ:

Работа № 3. КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА ВИТАМИН С Аскорбиновая кислота связана с системой глутатиона и участвует в тканевых окислительно-восстановительных процессах. Она необходима для гидроксилирования стероидных гормонов, образования гидрофолиевой кислоты, активации дофа-

мингидроксилазы. Принцип метода.

Аскорбиновая кислота способна легко окисляться и восстанавливать различные вещества (железосинеродистый калий, метиленовую синь, молекулярный йод, 2,6 - дихлорфенолиндофенол и др.).

37

берлинская лазурь (синего цвета)

Порядок выполнения работы:

К 5 каплям 1% раствора витамина С прилить 1 каплю 10% раствора едкого натра и 1 каплю 5% раствора железосинеродистого калия, перемешать, добавить 3 капли 10% раствора соляной кислоты и 1 каплю 1% раствора хлорного железа.

РЕЗУЛЬТАТ:

III.2. Контрольные вопросы.

В состав каких коферментов входит витамин В2?

Как выявить окисленную и восстановленную формы рибофлавина?

В каких реакциях участвует аскорбиновая кислота?

На чем основан принцип выявления аскорбиновой кисло-

ты?

В состав каких коферментов входит витамин РР?

Какое заболевание развивается при отсутствии в пище витамина РР?

Материал для самоподготовки: I а)1. с.204-247; II; III.

РАЗДЕЛ IV. ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН

Занятие № 9

38

ТЕМА. МИТОХОНДРИАЛЬНАЯ ЦЕПЬ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ И ПРОТОНОВ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАКРОЭРГОВ.

Цель занятия: 1.Сформировать знания о биологическом окисле нии как источнике энергии в живых системах.

2.Усвоить структуру и биологическую роль макроэргов, дыхательных ферментов и их коферментов.

3.Познакомиться с методикой определения макроэргов. Исходный уровень знаний:

- понятие об обмене веществ, его составных частях;

-связь обмена веществ с обменом энергии;

-строение клетки, роль митохондрий;

-химическая природа ферментов;

-коферментная функция витаминов. Содержание занятия.

I.2. Основные этапы обмена веществ.

Соотношение понятий метаболизм, анаболизм, катаболизм. Общие понятия о метаболических путях и энергетическом обмене.

Биологическое окисление и тканевое дыхание.

Дегидрирование субстратов как источник энергии для синтеза АТФ. Состав цепи переноса электронов и протонов при окислении субстратов.

Роль витаминов в тканевом дыхании.

Структура и функция коферментов дегидрогеназ.

Работа № 1. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАКРОЭРГИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ МЫШЦ (АТФ И

КРЕАТИНФОСФАТА)

АТФ и креатинфосфат являются основными макроэргами мышечной ткани. АТФ синтезируется главным образом в процессе окислительного фосфорилирования, а креатинфосфат – при участии АТФ в состоянии мышечного покоя. При активной работе мышц креатинфосфат дает энергию для синтеза АТФ из АДФ.

Принцип метода.

Фосфатные остатки АТФ и креатинфосфата легко отщеп-

39

ляются при кислотном гидролизе (т.н. лабильно связанный фос-

фор). Сравнивают содержание неорганического фосфора в пробах до и после гидролиза по цветной реакции с молибдатом аммония в присутствии аскорбиновой кислоты.

Порядок выполнения работы.

В пробирку внести 0,5 г мышечной кашицы, поместить на ледяную баню и добавить 5 мл охлажденного раствора ТХУ. Содержимое пробирки помешивать стеклянной палочкой в течение 5 мин. Экстракт профильтровать в мерную пробирку, стоящую на ледяной бане. Остаток кашицы залить дистиллированной водой (5 мл), через 5 мин. профильтровать в ту же мерную пробирку и довести объем фильтрата до 10 мл, добавив дистиллят.

Перенести из обеих пробирок в другие пробирки по 5 мл и добавить

Перемешать, оставить при комнатной температуре на 10 мин., колориметрировать на ФЭКе против воды, длина волны 670 нм.

Расчет. Определить разницу между оптической плотностью опытной пробы и контрольной. По калибровочному графику найти концентрацию лабильно связанного неорганического фосфора (А) в пробе.

Х = А ∙ ( 3,3 ∙ 400 ) ∙ 100, где

40