Praktikum-BH-1

антисыворотка, 2 -тест-антиген, 3-10 - последовательное разведение исследуемой пробы: 1/1, 1/2, 1/4, и т.д. до 1/128.

Работа № 5. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА НА БУМАГЕ, В АГАРОВОМ И В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЯХ

Принцип метода.

Молекулы белков обладают свободным электрическим зарядом, величина которого и знак зависят от соотношения основных и кислых ионизированных групп в молекуле. Под влиянием внешнего электрического поля заряженные молекулы белка передвигаются в растворе к противоположно заряженному полюсу. Разделение смеси белков на отдельные фракции происходит в результате различия относительной молекулярной массы и зарядов молекул белков, которые перемещаются в электрическом поле неодинаково. Скорость передвижения белковых молекул пропорциональна величине их свободного заряда и обратно пропорциональна размеру частиц и степени их гидратации. Электрофоретическое разделение белков широко используется как для диагностики заболеваний, так и для препаративных целей.

61

Рис. 5а. Разделение сыворотки крови человека с помощью электрофореза в геле агарозы и кривые, полученные при денситометрическом измерении электрофореграмм.

Нормальная сыворотка (А) и сыворотки больных с множественной миеломой (Б), циррозом печени (В) и нефротическим синдромом (Г).

Рис.5б. Разделение белков сыворотки крови в полиакриламидном геле с линейным градиентом концентраций в пределах 4-30%.

Работа № 6. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ МЕТОДОМ ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗА

Принцип метода.

Иммуноэлектрофорез впервые был предложен Грабарем и Уильямсом в 1953 году и представляет собой комбинацию электрофоретического разделения белков с последующей имму-

нопреципитацией в геле, что значительно повышает чувстви-

62

лей пробы Вельтмана?

Назовите основные фракции белков крови на электрофореграмме.

Перечислите иммунохимические методы определения белков.

Объясните основной принцип иммунохимических мето-

дов.

Материал для самоподготовки: I а)1. с.567-578; II; III.

Занятие № 18.

ТЕМА. СВЁРТЫВАНИЕ КРОВИ И ФИБРИНОЛИЗ

Цель занятия: 1.Ознакомиться с современными представлениями о свёртывании крови.

2.Знать роль основных факторов свёртывающей системы.

3.Усвоить природу противосвёртывающей системы крови.

4.Ознакомиться с методами определения фибриногена. Исходный уровень знаний:

-структура и биологическая роль белков;

-классификация белков;

-каталитическая функция белков;

-кровь: химический состав, физико-химические характеристики, функции;

-форменные элементы крови;

-отличие плазмы крови от сыворотки.

Содержание занятия.

I.2. Плазменные факторы свёртывания крови: место синтеза, строение, функция.

Тромбоцитарные факторы свёртывания: название, функция. "Внешний" и "внутренний" пути активации свёртывающей системы крови.

Схема фибринолиза.

Лекарственные препараты, используемые для лечения и профилактики тромбозов.

Гемофилии: природа, способы лечения.

64

II.1 Работа № 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ФИБРИНОГЕНА ГРАВИОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

(по Рутбергу Р.А.)

Принцип метода. При добавлении к плазме раствора хлористого кальция происходит свертывание фибриногена и выпадение его в осадок.

Количество выпавшего в осадок фибриногена определяют путем взвешивания сгустка на торсионных весах.

Порядок выполнения работы. В пробирку внести 1 мл плазмы и добавить 0,1 мл 5% раствора хлористого кальция. Пробирку встряхнуть и оставить в термостате при температуре 370С на 15 минут. Образовавшийся фибриновый сгусток отжать на фильтровальной бумаге до исчезновения следов влаги. Отжатый сгусток взвесить на торсионных весах с точностью до 1 мг. Полученный результат умножить на коэффициент 0.222. Количественный результат выражается в граммах на 1 литр плазмы.

РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД:

Клинико-диагностическое значение.

У здоровых людей концентрация фибриногена в плазме колеблется в пределах 2 - 4 г/л. Значительное повышение концентрации фибриногена отмечается при системных заболеваниях соединительной ткани и острых воспалительных процессах. Снижение обусловлено, в первую очередь, нарушением синтеза при заболеваниях печени и потреблением в большом количестве при ДВС синдромах.

Работа № 2. МИКРОМЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ

ФИБРИНОГЕНА В В ПЛАЗМЕ

65

Принцип метода. Спиртовый раствор -нафтола осаждает из плазмы фибрин-мономеры и их комплексы с фибринопептидами А и В, фибриногеном.

Порядок выполнения работы. В центрифужную пробирку внести 0.5 мл. плазмы и добавить 2 капли 2% раствора - нафтола. Пробирку встряхнуть и оставить в штативе при комнатной температуре на 10 минут. При наличии в плазме фибриногена В в пробирке образуется сгусток, нити или гранулы.

Клинико-диагностическое значение.

В норме фибриноген В в крови не определяется. Появление фибриногена В в плазме обусловлено патологическим нарастанием уровня тромбина в крови, поэтому положительная реакция на фибриноген В имеет большое значение для диагностики пред- и тромботических состояний, ДВС-синдромов.

РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД:

III.2. Контрольные вопросы.

Какова концентрация фибриногена в плазме крови у здоровых людей?

Укажите причины гиперфибриногенемии, гипофибриногенемии.

Когда в плазме определяется фибриноген В?

Материал для самоподготовки: I а)1. с. 599-607; II; III.

66

ЧА С Т Ь II

ФУ Н К Ц И И И О Б М Е Н

ОС Н О В Н Ы Х В Е Щ Е С Т В В О Р Г А Н И З М Е

РАЗДЕЛ VII. ОБМЕН И ФУНКЦИЯ УГЛЕВОДОВ

Занятие № 19

ТЕМА. ПЕРЕВАРИВАНИЕ И ВСАСЫВАНИЕ УГЛЕВОДОВ. СИНТЕЗ И РАСПАД ГЛИКОГЕНА. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ И КАЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ УГЛЕВОДОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ.

Цель занятия: 1.Повторить физико-химические свойства и биологическую роль углеводов.

2.Изучить процессы переваривания и всасывания углеводов.

3.Ознакомиться с обменом гликогена.

4.Овладеть методами качественного и количественного определения глюкозы в моче.

Исходный уровень знаний:

-строение моносахаридов;

-строение и свойства олигосахаридов;

-строение и свойства крахмала, гликогена, целлюлозы;

-классификация и биологическая роль углеводов;

-классификация и номенклатура ферментов. Содержание занятия.

I.2. Стереоизомерия моносахаридов. Циклические формы моносахаров. Реакции полуацетального гидроксила. Реакции с участием карбоксильной группы.

Физико-химические свойства и биологическое значение мальтозы, сахарозы и лактозы.

Особенности строения и биологическая роль гомо- и гетерополисахаридов.

Переваривание и всасывание углеводов. Синтез гликогена.

Гликогенолиз.

II.1. Работа № 1. КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА САХАР В МОЧЕ.

67

Для определения сахара в моче применяются качественные реакции Троммера, Фелинга, Ниландера, основанные на окислении свободной альдегидной группы углеводов (напр., глюкозы до глюконовой кислоты) и восстановления металлов (медь, висмут, и др.) из их окисных соединений. Эта реакция довольно быстро происходит при нагревании в щелочной среде. Восстановленная форма металлов окрашена в характерный цвет (напр., закись меди - в красный, висмут - в черный).

Химизм реакции Троммера см. ч.I, зан. №4, работа №1.

Проба с жидкостью Фелинга основана на том же принципе, что и реакция Троммера. Отличие и преимущество этой реакции заключается в том, что Фелинг предложил прибавлять сегнетову соль для связывания избытка гидрата окиси меди, из которого при нагревании образуется оксид меди (СuO) - осадок черного цвета, затемняющий реакцию при малых количествах глюкозы в исследуемом образце.

Порядок выполнения работы. а) Реакция Троммера.

К 5 кап. мочи прибавить 5 кап. 10% раствора едкого натрия и 5 кап. 1% раствора сернокислой меди, нагреть.

РЕЗУЛЬТАТ:

б) Реакция с жидкостью Фелинга.

К 20 кап. мочи прилить 10-20 кап. жидкости Фелинга и нагреть до кипения верхний слой жидкости.

РЕЗУЛЬТАТ:

РАБОТА № 2. ЭКСПРЕСС-МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ САХАРА В МОЧЕ.

Порядок выполнения работы.

68

Насыпать в пробирку небольшое количество порошка (состав: 1 часть сернокислой меди + 10 частей безводного углекислого натрия), прибавить несколько капель мочи, подогреть.

РЕЗУЛЬТАТ:

Клинико-диагностическое значение.

В норме сахар с мочой выделяется в ничтожно малых количествах и обычными методами не определяется.

Появление сахара в моче в количествах, которые можно определить обычными клиническими методами, носит название глюкозурии. Моча содержит, в основном, глюкозу и, реже, фруктозу и галактозу.

Глюкозурия может быть функциональная (пищевая, эмоциональная) и

патологическая (при заболевании почек, при сахарном диабете), когда в суточной моче может содержаться до 200-300 г глюкозы. Иногда глюкозурия наблюдается при беременности.

III.2.Контрольные вопросы.

Что является мономером крахмала и целлюлозы?

Какие виды амилаз вы знаете, где функционируют и - амилазы и как гидролизуют крахмал (гликоген)?

Что такое глюкозурия?

Когда отмечается физиологическая глюкозурия? Какие заболевания сопровождаются глюкозурией?

Материал для самоподготовки. а)1 с. 319-327, 665-669; II, III.

Занятие № 2О

69

ТЕМА. ГЛИКОЛИЗ, ГЛИКОГЕНОЛИЗ, ГЛЮКОНЕОГЕНЕЗ. ОКИСЛИТЕЛЬНОЕ ДЕКАРБОКСИЛИРОВАНИЕ ПИРУВАТА. ОБНАРУЖЕНИЕ ПРОДУКТОВ ГЛИКОЛИЗА В БИОЛОГИ-ЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ.

Цель занятия: 1.Изучить анаэробный и основной аэробный путь окисления глюкозы.

2.Ознакомиться с методами качественного опре-деления продуктов гликолиза и витамина В1.

Исходный уровень знаний:

-строение и физико-химические свойства основных углеводов;

-всасывание углеводов в желудочно-кишечном тракте;

-обмен гликогена;

-цикл трикарбоновых кислот;

-классификация и номенклатура ферментов;

-витамины В1, В2, В3, РР, липоевая кислота.

Содержание занятия.

I.2. Гликолиз: локализация в клетке, химизм, ферменты, коферменты, физиологическое значение, энергетическая ценность.

Сходство и различие гликолиза и гликогенолиза, а также гликолиза и спиртового брожения.

Глюконеогенез: химизм, ферменты, биологическая роль. Дихотомический путь окисления глюкозы: этапы, локализация в клетке, химизм, ферменты, коферменты, энергетическая ценность.

II.1. Работа № 1. ИЗУЧЕНИЕ ВЕЩЕСТВ, ОБРАЗУЮЩИХСЯ В ПРОЦЕССЕ ГЛИКОЛИЗА.

а) Открытие триозофосфатов. Принцип метода.

В процессе гликолиза образуются различные промежуточные фосфорилированные продукты (фосфорные эфиры гексоз, триоз и т.п.). Принцип метода определения фосфора заключается в образовании комплексной фосфорномолибденовой кислоты, которую затем восстанавливают гидрохиноном в молибденовую синь.

Порядок выполнения работы.

Смешать и оставить при комнатной

70