КонюховХроматография

воздействии на компоненты исследуемой смеси одного или нескольких силовых полей (С).

Первая часть определения (А) является общей для всех видов хроматографии, вторая часть (В) охватывает обыч* ную сорбционно*ситовую хроматографию, часть (С) харак* теризует полевую хроматографию.

Данный учебник базируется на курсе лекций «Хрома* тографические методы анализа», читаемом в РУДН студен* там специальности «Химия окружающей среды». В учеб* нике достаточно полно изложены наиболее распространен* ные методы хроматографического анализа смесей веществ

иосновы применения хроматографии для изучения физи* ко*химических свойств веществ и явлений.

1.1.ИСТОРИЧЕСКАЯ СПРАВКА

21 марта 1903 г. ассистент кафедры анатомии

ифизиологии растений Варшавского университета Миха* ил Семенович Цвет на заседании Биологического отделе* ния Варшавского общества естествоиспытателей прочи* тал доклад «О новой категории адсорбционных явлений и о применении их к биологическому анализу». В нем он рассказал о своей работе по разделению пигментов зеле* ных листьев растений на колонке с мелом.

Подробное изложение принципов и возможностей сво* его нового метода он дал в 1906 г. в двух статьях на немец* ком языке и в книге 1910 г. «Хлорофиллы в раститель* ном и животном мире».

М.С. Цвет также предложил название открытого им метода — «хроматография» (от греч. chroma, родительный падеж chromatos — цвет, краска), что означает «цветоза* пись». Он писал: «Если петролейно*эфирный раствор хло* рофилла профильтровать через столбик адсорбента, то пигменты по расположению их в адсорбционном ряду от* лагаются отдельными окрашенными зонами по столбику сверху вниз, благодаря тому, что пигменты с более силь* но выраженной адсорбцией вытесняют книзу слабее удер* живаемые... Как лучи света в спектре, в столбике угле* кислого кальция закономерно располагаются различные

компоненты смеси пигментов, давая возможность своего качественного и количественного определения. Получае* мый таким образом препарат я называю хроматограммой, а предлагаемую методику — хроматографической».

Со времени своего открытия предложенный термин по* терял свой смысл: с помощью хроматографии можно ис* следовать смеси любых веществ, в том числе и бесцвет* ных, но в знак уважения к заслугам автора термин сохра* нили. В 1918 г. кандидатура М. С. Цвета рассматривалась в списке девяти ученых, представленных на соискание Но* белевской премии, но премия была присуждена немецко* му химику Ф. Габеру. В 1972 г. международная научная общественность широко отмечала столетие со дня рожде* ния М. С. Цвета, что и явилось признанием огромного зна* чения метода, открытого им1.

По многим субъективным и объективным причинам после открытия хроматография практически не исполь* зовалась почти три десятилетия. Лишь в 1931 г. P. Кун, А. Винтерштайн и Е. Ледерер, используя методику М. Цве* та, разделили каротин на его компоненты и убедились в огромных возможностях хроматографии.

В1938 г. М. С. Шрайбер, аспирант Харьковского хи* мико*фармацевтического института, под руководством

Н.А. Измайлова, 30*летнего заведующего лаборатори* ей физической химии Института экспериментальной фармации, разработал основы тонкослойной хроматогра* фии. Им удалось получить плоские хроматограммы мно* гих настоек трав: полынной, белладонны, стручкового перца и др.

В1940 г. А. Мартин и Д. Сонж предложили вариант жидкостной распределительной хроматографии. Им уда* лось разделить ацетильные производные аминокислот на колонке, заполненной силикагелем, насыщенным водой, с использованием хлороформа в качестве элюента. В ра* боте было отмечено, что подвижной фазой может быть не только жидкость, но и газ. За открытие нового варианта

1 С точки зрения некоторых западных ученых, хроматография впер* вые была применена Рамзеем в 1905 г. для разделения смесей газов и паров [30].

хроматографии А. Мартин и Д. Сонж в 1952 г. получили Нобелевскую премию.

В1948 г. Е. Н. Гапон и Т. Б. Гапон удалось разделить смесь веществ с помощью осадочной хроматографии.

В1952 г. А. Мартин и А. Т. Джеймс разработали газо* жидкостную хроматографию.

В1955 г. в серийное производство были запущены га* зовые хроматографы.

Исключительное значение для развития хроматографии имело создание в 1956 г. М. Голеем варианта капиллярной газовой хроматографии (высокоэффективной газовой хро* матографии). Одновременно был изобретен пламенно*ио* низационный детектор, высокочувствительный и мало* инерционный, позволяющий проводить анализ сложных смесей, в том числе и с низким содержанием компонентов.

В1960 г. появились первые хромато*масс*спектромет* ры (хромасы), сильно упростившие проведение качествен* ного и количественного хроматографического анализа.

С конца 1960*х гг., когда были осуществлены первые успешные разделения оптических изомеров (энантиоме* ров), ведет свое начало энантиоселективная хроматогра* фия. За относительно короткий срок разработаны скорост* ные методы энантиомерного анализа практически всех классов органических соединений, созданы системы с си* мулированным подвижным слоем сорбента для многотон* нажного разделения рацемических смесей на составляю* щие их энантиомеры. Успех энантиоселективной хромато* графии способствовал бурному развитию асимметрического органического синтеза и энантиоселективного катализа.

В1962 г. М. Порат и Д. Флодин разработали метод си* товой хроматографии и применили его для разделения вы* сокомолекулярных соединений.

Использование высокихдавлений (с середины 1970*х гг.) позволило увеличить скорость течения подвижной жид* кой фазы и тем самым создать высокоэффективную жид* костную хроматографию (ВЭЖХ).

Промежуточным между газовой и жидкостной явля* ется хроматография с подвижной фазой в сверхкритиче* ском состоянии (флюид*адсорбционная хроматография),

основы которой разработали Дж. Рийндерс, Дж. Блемер

иМ. ван Кревелен в 1960*х гг.

Ссередины 1960*х гг. в обиход научных исследований был включен еще один вариант хроматографии — поле* вая хроматография, в которой разделение веществ проис* ходит под воздействием на поток подвижной фазы внеш* них силовых полей.

Роль хроматографии в XX в. увеличивалась с замет* ным ускорением. Нет признаков изменения этой тенден* ции и в нынешнем столетии. Конечно, разработка селек* тивных сенсоров, совершенствование метода прямого ин* жекционного анализа, а также компьютерная поддержка таких точных методов измерения, как ЯМР или масс*спек* трометрия, могут привести к автоматизации массовых рутинных анализов, однако приоритет в прямом разделе* нии сложных смесей и получении высокочистых веществ надолго еще останется за хроматографией [6].

1.2.КЛАССИФИКАЦИИ МЕТОДОВ ХРОМАТОГРАФИИ

Существующие методы хроматографии можно классифицировать по различным признакам: по агрегат* ному состоянию фаз, способу их относительного переме* щения, аппаратурному оформлению процесса и т. п. Рас* смотрим каждую из классификаций.

1. По способу относительного перемещения фаз разли* чают методы хроматографии: фронтальный, проявитель* ный (элюентный) и вытеснительный.

Фронтальный метод хроматографии. Это простейший по методике вариант хроматографии. Его суть состоит в том, что через колонку с неподвижной фазой непрерывно пропускают анализируемую смесь. Если это смесь компо* нентов А и В в растворителе S, то график изменения ин* тенсивности сигнала детектора I во времени t имеет вид, изображенный на рис. 1. Такой график называют хрома/ тограммой или (реже) выходной кривой.

Сначала из колонки выходит только растворитель S: сорбция веществ А и В замедляет их движение вдоль не* подвижной фазы. Затем вместе с растворителем начинает

выходить менее сорбирующийся компонент А, и, наконец, все три компонента раствора. Фронтальный метод в хро* матографической практике используется редко. Он при* меняется, например, для очистки растворов от примесей, если они сорбируются существенно лучше, чем основной компонент, или для выделения из смеси наиболее слабо сорбирующегося вещества.

Проявительный (элюентный) метод. В этом случае через колонку непрерывно пропускают элюент: газ*носи* тель или жидкий растворитель, адсорбционная способ* ность которого ниже, чем у любого из компонентов смеси. Далее в определенный момент времени с помощью шпри* ца (в случае жидкости) или крана*дозатора (при анализе газа) в колонку вводят порцию анализируемой смеси. При движении вдоль колонки компоненты смеси разделяются на зоны, перемещающиеся с различной скоростью: силь* но сорбирующееся вещество В отстает, а слабо сорбирую* щееся А «вырывается вперед». Типичная хроматограмма изображена на рис. 2. В газе или жидкости, выходящих из колонки, сначала появляется компонент А, далее — чистый элюент (нулевая линия), затем компонент В. Чем больше концентрация компонента в смеси, тем выше пик и больше его площадь.

Основные преимущества проявительного метода за* ключаются в следующем:

1)при выборе соответствующих условий компоненты могут быть практически полностью изолированы друг от друга и будут находиться лишь в смеси с элюентом, т. е. возможно полное разделение анализируемых веществ;

2)сорбент непрерывно регенерируется элюентом, по* этому после выхода наиболее сильно сорбирующегося ком* понента смеси сразу возможен следующий анализ;

3)если концентрация исследуемого компонента соот* ветствует линейному участку изотермы его сорбции, то время элюирования компонента при заданных условиях является постоянной величиной, которая может быть ис* пользована для целей идентификации;

4)возможна работа с малыми количествами смеси.

К недостаткам метода относится необходимость ис*

пользования больших количеств элюента, так как он по* стоянно пропускается через неподвижную фазу.

Вытеснительный метод. В этом методе движение ком* понентов по колонке осуществляется вытеснителем, т. е. веществом, сорбирующимся гораздо сильнее, чем любой из компонентов разделяемой смеси.

Смесь веществ (А + В) вводят в начало колонки (рис. 3а) и затем через колонку пропускают вытеснитель D. Он вы* тесняет вещества В и А. Вещество В, в свою очередь, в зоне (В + А) вытесняет вещество А, как слабее сорбирующееся. Через некоторое время вдоль колонки зоны веществ распре* делятся так, как это схематически изображено на рис. 3б.

Рис. 3

Распределение зон компонентов А, В и вытеснителя D в различные моменты хроматографирования:

а — начало анализа; б — произвольный момент времени; в — конец анализа.

нию компонента в смеси, высота ступеньки определяется чувствительностью детек*

тора к анализируемому веществу: чем выше чувствитель* ность, тем выше ступенька. На указанном рисунке детек* тор наиболее чувствителен к веществу В.

К недостаткам метода можно отнести следующее:

метод требует больших различий в адсорбционной спо* собности компонентов (в противном случае будет на* блюдаться наложение зон веществ друг на друга);

метод не позволяет работать с малыми количествами компонентов;

после каждого анализа колонку необходимо регенери* ровать — удалять вытеснитель.

2. В зависимости от природы процесса, обусловливаю*

щего распределение компонентов между подвижной и не* подвижной фазами, различают сорбционно/ситовую и по/ левую хроматографию. В свою очередь сорбционно*ситовая хроматография бывает распределительной, ионообменной, адсорбционной, аффинной, эксклюзионной, осадочной

ит. п.

Враспределительной хроматографии роль неподвиж* ной фазы выполняет нелетучая жидкость, нанесенная в виде тонкой пленки на поверхность твердого сорбента или стенки капиллярной колонки. Сорбент с жидкой фазой помещают в хроматографическую колонку (колоночная хроматография) или на поверхность пластинки (планар* ная хроматография). Через колонку продувают поток газа (газо*жидкостная хроматография) или прокачивают жид* кость (жидкостная хроматография). Анализируемую смесь

веществ подают в поток подвижной фазы (газа или жидко* сти). Вещества смеси имеют различную растворимость (кон* станту распределения) в пленке неподвижной жидкости и в результате многократных актов сорбции — десорбции в потоке подвижной фазы, происходит их разделение: слабо растворимые двигаются по слою неподвижной фазы быст* рее, а сильно растворимые отстают. В результате один и тот же путь (длину колонки) они пройдут за разное время.

Вслучае плоскостной хроматографии анализируемую смесь капают на пластинку, покрытую сорбентом с нане* сенной на нем жидкостью, пластинку помещают в рас* творитель — элюент. Последний за счет капиллярных сил перемещается вдоль слоя сорбента, увлекая за собой разделяемые вещества. Слабо сорбирующиеся вещества двигаются с большей скоростью и проходят больший путь за то же время (время анализа).

Ионообменная хроматография основана на различии констант ионообменного равновесия анализируемых ве* ществ между фазой адсорбента (неподвижная фаза) и под* вижной жидкой фазой.

Вадсорбционной хроматографии разделение веществ смеси происходит из*за различия в их адсорбируемости на поверхности твердой неподвижной фазы. Как и в случае распределительной хроматографии, неподвижную фазу (ад* сорбент) помещают в колонку, через которую продувают поток газа (газо*адсорбционная хроматография) или про* качивают поток жидкости (жидкостная хроматография). Анализируемую смесь веществ подают в поток. В процес* се хроматографирования осуществляются многократные акты адсорбции и десорбции компонентов на поверхно* сти адсорбента. Среднее время пребывания на поверхно* сти молекул слабо адсорбирующихся веществ меньше, чем

усильно адсорбирующихся, в результате они первыми выходят из колонки, последними выходят молекулы наи* более сильно адсорбирующихся веществ.

Осадочная хроматография основана на различной рас* творимости осадков в подвижной фазе.

Разделение веществ в аффинной хроматографии про* исходит за счет биоспецифического взаимодействия ком*

понентов с аффинным лигандом, ковалентно связанным с нерастворимым носителем. Лигандами могут быть, напри* мер, ингибиторы, кофакторы, субстраты, а носителями — силикаты, полиалкиламиды, декстрины, целлюлоза, хи* тин, крахмал и т. п.

Вэксклюзионной хроматографии разделение основано на различии проницаемости молекул разделяемых веществ

внеподвижную фазу (в случае гель*хроматографии непод* вижной фазой служит гель) и обусловлено различными раз* мерами разделяемых молекул. Компоненты элюируются в порядке уменьшения их молярной массы. Первыми из ко* лонки выходят вещества, которые из*за больших размеров молекул слабо проникают вглубь неподвижной фазы и дви* гаются практически вместе с фронтом элюента. Последни* ми выходят молекулы, способные проникать в поры непод* вижной фазы и задерживаемые ею дольше всего.

Вполевой хроматографии разделение компонентов происходит под действием внешнего поля: гравитацион* ного, электромагнитного и т. п. Наибольшее распростра* нение получил метод проточного фракционирования в поле сил (ППФ) (за рубежом — FFF (Flow, Field, Fractio/ nation)).

3. В зависимости от агрегатного состояния подвиж* ной фазы различают газовую и жидкостную хроматогра* фию. В табл. 1 приведены названия хроматографических методов в зависимости от природы подвижной и непод* вижной фаз.

1 2 3 4 5 6 2 7 8 7

1234456573859 3 365 475

3 545 4 5 3 3 4 4 9 59 63

1