КонюховХроматография

взаимодействия анализируемых веществ с адсорбентом не* подвижной фазы и растворителем. Их природа — диполь* дипольное взаимодействие между постоянными или ин* дуцированными диполями, образование водородной свя* зи, образование *комплексов или комплексов с переносом заряда. Возможна и хемосорбция, которая может привес* ти к значительному повышению времени удерживания, резкому снижению эффективности, появлению продуктов разложения или необратимой сорбции веществ.

Изотермы адсорбции веществ могут быть линейными, выпуклыми и вогнутыми. При линейной изотерме адсорб* ции пик вещества симметричен и время его удерживания не зависит от массы пробы. Чаще всего изотермы адсорб* ции веществ нелинейны и выпуклы, что приводит к неко* торой асимметрии пиков с образованием «хвоста».

Наибольшее применение в ВЭЖХ находят адсорбенты из силикагеля. Значительно реже используется оксид алю* миния и крайне редко — другие адсорбенты, широко при* меняемые в классической колоночной и тонкослойной хроматографии. Основная причина этого заключается в недостаточной механической прочности большинства ад* сорбентов, не позволяющей использовать их при повышен* ных давлениях, характерных для ВЭЖХ.

Полярные группы, обусловливающие адсорбцию и на* ходящиеся на поверхности силикагеля и оксида алюми* ния, по свойствам близки. Поэтому обычно порядок элюи* рования веществ и элюотропный ряд растворителей для них одинаковы. В тех же случаях, когда селективности адсорбентов различаются, предпочтение отдают более под* ходящему для данной конкретной задачи. Например, ок* сид алюминия обеспечивает лучшую избирательность при разделении некоторых многоядерных ароматических уг* леводородов.

В настоящее время адсорбционная хроматография практически полностью вытеснена обращенно*фазной и нормально*фазной ВЭЖХ. Это объясняется большой про* должительностью процесса установления равновесия ад* сорбентов с растворителем, в микроколичествах содер* жащим воду, и трудностью приготовления растворителей

с определенной и воспроизводимой влажностью. Это обу* словливает низкую точность анализа. По этой же причи* не невозможно использовать градиентное элюирование, так как возврат к исходному состоянию системы слиш* ком длителен.

Недостатком адсорбентов, особенно оксида алюминия, является также их каталитическая активность. Получаю* щиеся в результате каталитических реакций вещества мо* гут необратимо сорбироваться, накапливаясь на начальном участке колонки и тем самым изменять природу сорбента. Указанные процессы приводят к повышению сопротивле* ния колонки или даже к полной ее забивке.

2. Распределительная ВЭЖХ. Это вариант ВЭЖХ, в котором разделение смеси на компоненты осуществляет* ся за счет различия их коэффициентов распределения ме* жду двумя несмешивающимися фазами: растворителем (подвижная фаза) и фазой на сорбенте (неподвижная фаза).

Исторически первые сорбенты, получающиеся путем нанесения жидкой фазы (оксидипропионитрила, парафи* нового масла и др.) на пористые носители, были анало* гичны тому, как готовят сорбенты для газожидкостной хроматографии. Неподвижную фазу и растворитель вы* бирают такими, чтобы они были практически взаимно не* растворимыми. Примером такой комбинации фазы и рас* творителя могут служить: трис (цианэтокси) пропан и гек* сан, парафиновое масло и вода.

Вымывание фазы растворителем уменьшает ее коли* чество, что в свою очередь приводит к изменению време* ни удерживания веществ, к тому же на сорбенте появля* ются не покрытые фазой центры адсорбции, вызывающие образование «хвостов» пиков.

С этим недостатком боролись, предварительно насыщая растворитель веществом фазы. Унос фазы также снижали при использовании более вязких и менее растворимых по* лимерных пленок, однако в этом случае из*за недостаточ* ной скорости массопередачи эффективность колонок была низкой.

Более продуктивным оказался путь химической при* вивки жидкой фазы к поверхности носителя (привито/

фазный сорбент), когда унос ее становится физически не* возможным.

Первые привито*фазные сорбенты были получены за* мещением силанольных групп, находящихся на поверх* ности силикагеля, остатками спиртов или аминов при их химическом взаимодействии. Применение этих так назы* ваемых щеточных сорбентов обеспечивало достаточно вы* сокую эффективность колонок при отсутствии уноса фазы

истабильности времен удерживания веществ. Однако при* менение водных слабоосновных или слабокислых раство* рителей резко снижало устойчивость таких сорбентов из* за их гидролиза.

Применение алкилхлорсиланов и их производных по* зволило по аналогичной технологии получать более устой* чивые привито*фазные сорбенты разного типа: как с по* лярными, так и неполярными группами на поверхности.

Наибольшее распространение для распределительной хроматографии в настоящее время получили нитрильная

иаминная привитые фазы. Каждую из них получают с использованием соответствующего силана (диметилами* нопропилхлор или диметилцианпропилхлорсилана).

Успешное применение таких сорбентов для ВЭЖХ спо* собствовало росту их производства. Каждая фирма выпус* кает сорбенты, как правило, на основе своего силикагеля и по оригинальной технологии. В результате сорбенты, на* зывающиеся одинаково (например, силикагель с привитым октадецилсиланом), могут иметь сильно различающиеся характеристики. Это связано с различием пористой струк* туры силикагелей и условиями прививки: прививаться мо* гут моно*, ди* или трихлорсиланы, при этом получаются мономерный, полимерный или смешанный слой фазы.

Сложность технологии прививки, ее многостадийность приводят к тому, что партии сорбентов, полученные по одной технологии, одной фирмой*производителем могут иметь различающиеся характеристики.

Привитые фазы могут быть использованы в двух вари* антах распределительной ВЭЖХ: для нормально*фазной (с неполярными элюентами) и обращенно*фазной (с поляр* ными элюентами).

Нормально/фазная распределительная хроматография с привитыми фазами. Хроматографирование на нормаль* но*фазных сорбентах аналогично адсорбционной ВЭЖХ на силикагеле или оксиде алюминия, с теми же элюотроп* ными рядами растворителей и близкими порядками элюи* рования соединений разных классов. Однако за счет раз* ной химической природы силанольных, амино* и нитриль* ных групп возможно различие в селективности разделения смесей, позволяющее отдать предпочтение тому или ино* му сорбенту.

Следует помнить, что при использовании сорбентов с аминофазами не следует применять в качестве раствори* телей вещества с альдегидными или кетонными группа* ми, так как возможно их химическое взаимодействие с привитой фазой с образованием оснований Шиффа.

Аминофаза легко окисляется, поэтому следует исклю* чить действие на сорбент сильных окислителей.

Применяют в хроматографии также привитую поляр* ную фазу, содержащую две гидроксильные группы. Ее называют «диольной», или просто «диол». Однако сор* бенты такого вида выпускает меньшее число производи* телей.

Обращенно/фазная распределительная хроматогра/ фия с привитыми фазами. Вариант распределительной хроматографии, в котором используют сорбент с приви* тыми неполярными (как правило, длинными алкильны* ми или алкилсилильными) группами и полярный раство* ритель, например водный раствор метанола, получил на* звание обращенно*фазной ВЭЖХ. Этот не совсем удачный термин, указывающий на перемену полярности неподвиж* ной и подвижной фаз, прижился, стал общепринятым и означает лишь одно: подвижная фаза — полярная, а не* подвижная — неполярная.

В настоящее время этот метод является основным в ВЭЖХ. Этому способствовали успешные разработки и бы* строе внедрение в производство сорбентов, имеющих при* витые алкилсилильные группы разной длины (от С2 до С12 и с прямой алкильной цепью, фенильной и дифенильной группами).

Растворители, используемые для этого метода (ацето* нитрил, метанол, вода, тетрагидрофуран), позволяют ра* ботать в широком УФ*диапазоне (начиная с 190–210 нм (ТГФ с 220 нм)), так как они прозрачны. Это обусловлива* ет применение практически универсального в данном слу* чае детектора — УФ*спектрофотометра. С его помощью можно проводить анализ сахаров, жиров, сложных эфи* ров, спиртов, олефинов и т. п.

Растворители, используемые в обращенно*фазной ВЭЖХ, растворяют практически все группы веществ — находящихся в организме человека, биологических объ* ектах, используемых в виде лекарственных препаратов, пестицидов, гербицидов, широко используемых в органи* ческой химии, нефтехимии, биоорганической химии.

Сорбенты обращенно*фазной ВЭЖХ быстро приходят в равновесие с растворителями и при изменении их состава, что позволяет переходить от одной методики к другой с ис* пользованием одной и той же колонки, а также широко применять градиентное элюирование с быстрым восстанов* лением равновесия сорбента с исходным растворителем.

Сорбенты дают возможность использовать растворите* ли с широким диапазоном физико*химических свойств, а также различные добавки в них: соли, кислоты и основа* ния, ион*парные реагенты, органические модификаторы.

Регенерацию растворителей осуществляют ректифика* цией, а загрязненный сорбент промывают и приводят в ра* бочее состояние пропусканием растворителя через колонку.

Следует помнить, что и для обращенно*фазной хрома* тографии свойственна общая проблема ВЭЖХ: возмож* ное изменение характеристик сорбентов при переходе от продукции одного производителя к продукции другого и даже изменение их при переходе между партиями сорбен* та одного производителя.

3.1.1.5. ТЕОРИЯ РАЗДЕЛЕНИЯ ВЭЖХ

Общие соображения для газовой хроматографии, рас* смотренные в главе 1, применимы и в случае жидкостной хроматографии с учетом того, что коэффициент моле* кулярной диффузии на четыре*пять порядков ниже, чем

В качестве подвижной фазы применяют водные рас* творы солей, кислот, оснований и растворители, имеющие высокую диэлектрическую проницаемость и способность ионизировать соединения, например жидкий аммиак. Ино* гда в воду добавляют небольшое количество смешивающих* ся с водой органических растворителей — метанола, этано* ла, ацетонитрила, тетрагидрофурана. Обычно работают с буферными растворами, позволяющими поддерживать по* стоянные значения рН. Применяют ацетатный, фосфат* ный, цитратный, формиатный, аммиачный, боратный бу* феры. При анализе значение рН раствора выбирают таким, чтобы молекулы анализируемых веществ были полностью ионизированы: обычно для кислот рН ! рК + 1,5, а для оснований — рН ! рКb + 1,5.

Из трех вариантов ионообменной хроматографии: элюентной, фронтальной и вытеснительной — наиболь* шее применение в практике нашла элюентная хромато* графия — после проведения анализа не нужна регенера* ция колонки.

Методика элюентной ионообменной хроматографии со* стоит в следующем: неподвижную фазу в колонке снача* ла обрабатывают раствором электролита, который будет использован в качестве элюента El. Обработку проводят до тех пор, пока ионит R2A не будет полностью переведен в форму иона R2El, являющегося обмениваемым ионом элюента:

R2A + zEl R2El + Az .

Далее в верхнюю часть колонки вводят небольшой объ* ем анализируемой пробы и через колонку пропускают элю* ент. Вытекающий из колонки элюент анализируется в де* текторе.

Обычно ионообменное разделение проводят при тем* пературах 20–60 С. Чем выше температура, тем меньше вязкость подвижной фазы и тем выше эффективность колонки. Верхний температурный предел обусловлен низкой термостабильностью ионообменников: они вы* держивают температуру до 60 С, и лишь некоторые по* лимерные катионообменники стабильны до 80 С. Био*

химические анализы проводят при более низких темпе* ратурах, обычно при 4 С.

Время удерживания анализируемой пробы снижается

сувеличением ионной силы подвижной фазы и возраста* ет с увеличением ионообменной емкости сорбента. Ион* ная сила подвижной фазы, в свою очередь, зависит от кон* центрации буфера и природы добавленных солей.

Уменьшение концентрации буферного раствора уве* личивает сродство адсорбента к разделяемым веществам, что приводит к увеличению времени их удерживания. Обычно концентрацию буфера поддерживают в интерва* ле 0,001–6 моль/дм3. Верхняя граница определяется рас* творимостью солей, используемых в качестве буфера, а нижняя — свойствами буфера: в более слабом растворе не удается поддерживать требуемый показатель рН. Сле* дует избегать применения концентрированных буферных растворов, так как возможно выпадение осадка и заби* вание им колонок.

Время удерживания зависит от рН подвижной фазы:

сповышением рН оно увеличивается при анионообменном разделении и уменьшается при катионообменном. Особен*

но заметно это влияние при рН раствора, близком к рКb веществ.

Суммируя сказанное, можно заключить, что время удерживания в ионообменной хроматографии уменьша* ется:

1)с повышением температуры;

2)с повышением концентрации буферного раствора;

3)со снижением степени ионизации вещества при из* менении рН элюента.

Вводимые количества анализируемых веществ не долж* ны превышать 5% суммарной ионообменной емкости не*

подвижной фазы. Так, для соединений с относительной молярной массой 200–500 допустимо введение 50 мг про* бы на 1 г полимерного сорбента.

Ионообменная хроматография незаменима при разде* лении высокополярных веществ (аминокислот, пептидов, сахаров и т. п.), которые без перевода в летучие производ* ные не могут быть проанализированы методом ГЖХ.

Ионообменную хроматографию широко применяют в медицине, биологии, биохимии, для контроля окружаю* щей среды, при анализе содержания лекарств и их мета* болитов в крови и моче, ядохимикатов в пищевом сырье, а также для разделения неорганических соединений, в том числе радиоизотопов, лантаноидов, актиноидов и др.

Применение ионообменной хроматографии в биологии позволило наблюдать за образцами непосредственно в био* средах, уменьшая возможность перегруппировки или изо* меризации, которые могут привести к неправильной ин* терпретации конечного результата.

3.1.3.ЭКСКЛЮЗИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ (ГЕЛЬ#ХРОМАТОГРАФИЯ)

Эксклюзионная хроматография — это один из методов жидкостной колоночной хроматографии, основанный на неодинаковой способности молекул разного размера про* никать в поры (межмолекулярное пространство) непод* вижной фазы.

Анализируемый раствор пропускают через колонку, заполненную гранулированным гелем (неподвижная фаза). Частицы геля имеют высокоразвитую пористую структу* ру, заполненную растворителем. При анализе первыми из колонки выходят наиболее крупные молекулы (большей молярной массы), способные проникать в минимальное число пор неподвижной фазы. Последними выходят ве* щества с малыми размерами молекул, свободно проникаю* щие в поры (рис. 60). В названии метода отражен меха* низм процесса: от англ. size exclusion — исключение по размеру. В отличие от сорбционной хроматографии, при эксклюзионной хроматографии неподвижная фаза оста* ется химически и сорбционно инертной и с разделяемыми веществами практически не взаимодействует.

Принципиальной особенностью метода является воз* можность разделения молекул по их размеру в диапазоне практически любых молярных масс, что делает его неза* менимым при исследованиях синтетических высокомоле* кулярных веществ, состоящих из смеси полимергомоло* гов и биополимеров.

Рис. 60

Принцип разделения и детектирования пробы

вэксклюзионной хроматографии:

А— ввод образца; В — разделение по размерам; С — выход крупных макромоле* кул; D — выход мелких макромолекул.

Различают гель/проникающую хроматографию (ГПХ), в которой элюентом служит органический растворитель, и гель/фильтрацию, где элюент — вода.

Удерживание молекул в колонке определяется интен* сивностью их диффузии в поры и зависит главным обра* зом от соотношения размеров молекул и пор неподвиж* ной фазы. Молекулы с самыми малыми размерами (в том числе и молекулы растворителя) проникают во все поры, и поэтому движутся через колонку наиболее медленно. Их удерживаемый объем равен полному объему растворите* ля Vt. Все молекулы, размер которых больше размера пор сорбента, не могут попасть в них (полная эксклюзия) и проходят по каналам между частицами. Они элюируются из колонки с одним и тем же удерживаемым объемом,