КонюховХроматография

смесь помещают в сосуд с сорбентом и выдерживают до полного связывания исследуемого компонента. Затем сор* бент (в колонке или сосуде) промывают буферным раство* ром для удаления несвязавшихся веществ, после чего де* сорбируют исследуемый компонент. Десорбция (элюция) последнего обычно достигается повышением ионной силы, изменением рН буферного раствора или добавлением в него органического растворителя, что ослабляет взаимодейст* вие лиганд — ферментов. Более избирательна десорбция раствором лиганда.

Аффинная хроматография отличается чрезвычайно высокой избирательностью, присущей биологическим взаи* модействиям. Нередко однократное хроматографирование позволяет полностью очистить нужный белок. Это обстоя* тельство оправдывает большие усилия на приготовление аффинного сорбента, что не всегда оказывается легкой за* дачей из*за возможной утраты биологическими молеку* лами способности к специфическому взаимодействию в ходе их химического присоединения к матрице.

Одной из разновидностей аффинной хроматографии является металхелатная хроматография, основанная на образовании комплексов между нанесенным на сорбент ио* ном металла, например кадмия или никеля (никель*хелат* ная хроматография), и специфическим линкером, обычно шесть*десять остатков гистидина, химически связанным с целевым белком (см. рис. 63). Особенно часто данный ме* тод применяется при очистке генноинженерных белков, генетический код которых заклонирован в специально сконструированные плазмиды. В результате этого моле* кула белка экспрессируется с присоединенным полигис* тидиновым концом, за счет которого она специфически связывается ионом металла при нанесении на колонку, а примеси при этом не задерживаются, что позволяет дос* тичь очень большой чистоты целевого продукта при ми* нимальных затратах. Также, при необходимости, возмож* но проведение ренатурации связанных с сорбентом бел* ков, например, обратным градиентом мочевины. После этого уже можно элюировать чистый биологически актив* ный белок. Около десяти гистидиновых остатков присое*

динены к белку с помощью генетической инженерии, на* пример сочетанием сайт*специфического мутагенеза с по* лимеразной цепной реакцией (ПЦР). Гистидиновые остат* ки прочно связываются с гранулами, сделанными из ни* кель*хелатирующей смолы. Также возможен несколько иной вариант аффинной хроматографии, в котором непра* вильно свернутый белок с помощью шаперонов сворачи* вается правильным образом и элюируется буферным рас* твором.

3.2.ПЛАНАРНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

3.2.1.ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ (ТСХ)

Этот метод хроматографии наиболее прост в ап* паратурном оформлении, достаточно оперативен и в настоя* щее время занимает одно из ведущих мест среди методов анализа органических и биоорганических соединений. Про* должительность анализа здесь исчисляется минутами, по* этому ТСХ часто применяют при экспресс*анализах.

Методика тонкослойной хроматографии заключается в следующем: поверхность стеклянной пластинки покры* вают тонким слоем адсорбента (для этого обычно наносят слой суспензии и жидкость испаряют), в качестве которо* го чаще всего используют силикагель, несколько реже — оксид алюминия. Иногда применяют и смешанные непод* вижные фазы. Например, для определения микроколи* честв пестицидов используют силикагель с крахмалом, силикагель с гипсом или оксид алюминия с гипсом. Про* мышленность выпускает пластинки, готовые к проведе* нию практически любых анализов.

На стартовую линию наносят анализируемые вещест* ва и их смеси. Край пластинки, ниже стартовой линии, погружают в растворитель. По мере продвижения жидко* сти по пластинке происходит разделение веществ смеси на адсорбенте. Границу подъема жидкости отмечают, пла* стинку сушат и проявляют для обнаружения пятен ве* ществ. Измеряют расстояние от центра пятна до линии старта L1 и L2 (см. рис. 64), а также расстояние от линии

В. Ю. КОНЮХОВ. ХРОМАТОГРАФИЯ

фронта жидкости до старто* вой линии В. Их отношение друг к другу Rf = Li/B опре* деляет положение каждого вещества на данной хрома* тограмме (иногда эту вели* чину называют запаздыва* нием). Rf также можно рас* сматривать как отношение скорости движения центра хроматографической зоны к скорости подвижной фазы. Она является характеристи* кой элюентной способности исследуемого соединения на данном адсорбенте и зависит от ряда факторов: толщины слоя адсорбента, природы

растворителя, количества нанесенного вещества и т. д. Если нельзя точно установить положение фронта раство* рителя В, то на величину Rf будут влиять систематиче* ские ошибки. Потеря компонентов подвижной фазы, уже присутствующих в слое сорбента, или их накопление так* же влияют на величину Rf. В первом случае значения Rf систематически завышены, а во втором — систематиче* ски занижены.

Для того чтобы получить истинные значения Rf, необ* ходимо выполнять следующие требования:

постоянство условий вдоль пути разделения;

исключение потерь подвижной фазы;

точное определение положения фронта растворителя путем измерения и расчета его действительного поло* жения;

исключение случайных влияний в результате испаре* ния при нанесении пробы.

По аналогии с газовой хроматографией для оценки эф*

фективности процесса применяют коэффициент емкости k , определяющий поведение (природу) вещества в хрома* тографическом процессе. Он равен отношению времени на*

хождения вещества в неподвижной фазе к времени его на* хождения в подвижной фазе:

k1 2 tR . tm

Полный цикл разделения в ТСХ занимает период вре* мени tm. В элюентной хроматографии измерения начина* ют лишь через период времени tm. Если данное вещество характеризуется коэффициентом емкости k , то продол* жительность элюирования составляет k tm. Таким обра* зом можно найти основные соотношения между Rf и k .

Пусть для исследуемого вещества Rf = 0,1. Время, за которое это вещество приближается к фронту растворите* ля, составляет 9 tm, т. е. это случай, когда выполняются условия непрерывной ТСХ, которые по существу сходны с условиями в колонке для элюентной хроматографии. Та* ким образом, можно записать:

Rf 1 k2131.

Для идентификации веществ обычно применяют мет/ чики («свидетели»). С этой целью хроматографируют на пластинке известное вещество («свидетель») и разделяе* мую смесь веществ вместе. В этом случае Rf исследуемого вещества выражается отношением расстояния, пройден* ного веществом от точки старта, к аналогичному расстоя* нию, пройденному «свидетелем».

Еще одна характеристика ТСХ — число разделений. Это число веществ, которое можно полностью разделить между линией старта (Rf = 0) и фронтом элюента (Rf = 1), если хроматографические условия вдоль пути разделения постоянны. Для уточнения отметим, что в количествен* ной хроматографии число разделений определяют как максимальное число полностью разделенных веществ, со* ответствующее интервалу значений коэффициента k от 0 до 10 или интервалу значений Rf от 1 до 0,091.

Очень важно при проведении тонкослойной хромато* графии нанести оптимальное количество анализируемого вещества или смеси. Избыточный объем дает чересчур

большие пятна неправильной формы, которые сливаются с пятнами соединений, имеющих близкое значение Rf.

Хроматографирование обычно осуществляют следую* щим образом: исследуемую смесь веществ растворяют в эфи* ре, хлороформе или в каком*либо другом подходящем рас* творителе. На хроматографической пластинке на расстоя* нии 1,5 см от нижнего края простым карандашом намечают стартовую линию и на одинаковом расстоянии от нее осто* рожным прикосновением капилляра, чтобы слой не на* рушался, наносят анализируемый раствор (0,1–50 мкл). Диаметр пятна при этом не должен превышать 5–7 мм, расстояние между отдельными пятнами не менее 1 см. Затем пластинку помещают в растворитель. В зависимо* сти от направления поступления растворителя на пластин* ку различают методы восходящей, нисходящей и горизон* тальной хроматографии (линейный вариант ТСХ).

Хроматографию называют восходящей, если раствори* тель поступает на пластинку снизу вверх (под действием капиллярных сил). Растворитель или смесь растворителей наливают в хроматографическую камеру в таком объеме, чтобы поставленная вертикально пластинка с нанесенным веществом погружалась на 5 мм. Для насыщения камеры парами растворителя рекомендуется на заднюю стенку ка* меры прикреплять смоченный растворителем лист фильт* ровальной бумаги, доходящий до дна сосуда.

Хроматографию называют нисходящей, если раство* ритель поступает на пластинку сверху вниз. В некоторых случаях для лучшего разделения веществ с близкими зна* чениями Rf применяют проточную хроматографию. Она осуществляется при непрерывном поступлении свежего растворителя на пластинку. Растворитель продвигается по адсорбенту до конца пластинки и стекает с нее или про* сто испаряется.

Обычно растворитель пропускают вдоль пластинки с адсорбентом один раз. Однако для лучшего разделения компонентов смеси часто проводят повторное хроматогра* фирование (с другим или тем же самым растворителем). В случае многокомпонентных смесей применяют и двумер/ ную хроматографию, при которой повторное хроматогра*

фирование осуществляют движением растворителя в на* правлении, перпендикулярном первоначальному.

Выбор растворителя для такой хроматографии, как правило, производится эмпирически с учетом полярности разделяемых компонентов и растворителей. При оценке полярности растворителей учитывают элюотропный ряд Шталя, в котором растворители расположены в порядке возрастания их диэлектрической проницаемости. Прини* мается, что адсорбционная способность соединений, содер* жащих функциональные группы, увеличивается в следую* щей последовательности:

–СН = СН– < –ОСН3 < –С =

= О < –СНО < –SH < –NH2 < –ОН < –СООН.

Если в молекуле вещества одновременно присутствует несколько заместителей, то указанная закономерность мо* жет изменяться.

На практике в основном используют линейный вари* ант тонкослойной хроматографии, но для решения неко* торых задач применяют круговую ТСХ. Этот вариант ТСХ часто называют высокоэффективной тонкослойной хро/ матографией (ВЭТСХ). Важной особенностью круговой хроматографии является более высокая эффективность разделения, что достигается организацией на пластинке градиента скорости распределения подвижной фазы. В ре* зультате верхняя часть зоны разделяемых компонентов двигается медленнее, чем нижняя граница зоны. Это при* водит к сжатию (концентрированию) зон соединений в направлении движения фронта подвижной фазы. Элюент в этом случае подают в центр пластинки.

Для детектирования бесцветных веществ на хромато* грамме чаще всего используют явление флуоресценции. Так, для обнаружения веществ, поглощающих в УФ*об* ласти спектра, применяют слои адсорбента, содержащие флуоресцирующее вещество, или опрыскивают хромато* грамму после анализа раствором флуоресцирующего ве* щества. При освещении такой хроматограммы УФ*светом анализируемые вещества обнаруживаются в виде темных пятен.

Часто для обнаружения веществ на хроматограмме пластинки опрыскивают окрашивающими реагентами. Последние бывают двух типов:

1)реагенты общего назначения, взаимодействующие

сцелым рядом соединений различного типа (пары йода, фосфорномолибденовая кислота, родамин В и т. п.);

2)специфические реагенты, указывающие на присут* ствие лишь определенного соединения или функциональ* ной группы.

Так, для обнаружения хлорорганических соединений обычно применяют раствор азотнокислого серебра и 2*фе* ноксиэтанола или аммиака в ацетоне с последующим УФ*

проявлением. Такая методика позволяет обнаружить до 0,1"0,5 мкг препарата. Кроме указанного реактива для де* тектирования пятен хлорорганических пестицидов, при* меняют также 0,1 М раствора марганцовокислого калия, дифениламин, пары йода, спиртовые растворы о*толиди* на или о*дианизидина. Для обнаружения фосфороргани* ческих соединений, содержащих серу, применяют смесь бромтимолсинего и азотнокислого серебра, хлористый палладий, 2,6*дихлор*N*хлорхинонамид.

Методы количественного анализа хроматограмм в тонком слое можно разделить на две группы. В первой раз* деленные вещества исследуют непосредственно на слое ад* сорбента, а во второй — анализируемые вещества вымы* вают из слоя адсорбента и далее определяют их количест* ва тем или иным методом.

В первой группе методов получило наибольшее распро* странение визуальное сравнение размера пятна и интен* сивности его окраски с пятнами стандартных растворов. Для этого на одной пластинке с пробой анализируемых веществ хроматографируют пробы эталонных образцов, содержащих известные их количества. Метод визуально* го сравнения достаточно оперативный и не требует специ*

ального оборудования. Обычно он применяется для оце* ночных измерений (точность 20%).

Иногда проводят измерение площади пятна с помощью планиметра или переносят хроматограмму на миллимет* ровую бумагу и находят число покрытых ею клеточек. Да*

лее строят калибровочную кривую в координатах: количе* ство вещества (мг) — площадь пятна (мм2). Из полученной кривой, зная площадь пятна анализируемого вещества, оп* ределяют его содержание в пробе. Иногда вместо калибро* вочной кривой для каждой концентрации определяемого соединения изготовляют шаблоны, вырезанные из фоль* ги или миллиметровой бумаги. Шаблоны разных площа* дей накладывают на пятно хроматограммы и добиваются их совпадения.

Во втором случае для проведения количественного ана* лиза вещества вымывают из слоя адсорбента. Полученные таким путем растворы анализируют, например, спектро* фотометрически или с помощью масс*спектрометра.

3.2.2.ХРОМАТОГРАФИЯ НА БУМАГЕ

Впервые метод бумажной хроматографии (БХ) приме* нили для разделения и идентификации аминокислот в 1943 г. В зависимости от природы процесса разделения БХ принято классифицировать на распределительную, ад* сорбционную и ионообменную. Методика БХ (как и тон* кослойной хроматографии) проста и оперативна, что в со* четании с микроколичествами анализируемых веществ обусловливает широкое распространение метода.

При хроматографировании на бумаге разделение ана* лизируемых веществ происходит в результате многократ* ных актов их адсорбции на целлюлозе бумаги (или абсорб* ции в воду, пропитывающую бумагу — неподвижная фаза)

идесорбции в элюирующий раствор — подвижная фаза. Бумага должна быть однородной по плотности, химиче* ски и адсорбционно*нейтральной. В настоящее время про* мышленность России выпускает четыре сорта хроматогра* фической бумаги № 1, 2, 3, 4. Каждый номер отличается по плотности, а следовательно, и скорости движения рас* творителя. Бумагу № 1 и 2 называют «быстрой», а № 3

и4 — «медленной». Выпускают и специальные сорта бу* маги с высоким содержанием карбоксильных групп (для разделения катионов), а также бумаги, содержащие ио* ниты или другие адсорбенты.

Хроматографирование на бумаге проводят следующим образом. На полоску хроматографической бумаги нано* сят каплю раствора, содержащую смесь веществ, и дают ей высохнуть. Один конец бумаги опускают в подходящий растворитель. Сосуд с растворителем плотно закрывают, чтобы не происходило изменение его состава и не измени* лось насыщение камеры его парами.

Растворитель, двигаясь под действием капиллярных сил вдоль полоски бумаги, захватывает компоненты ана* лизируемой смеси. В результате процессов адсорбции — десорбции происходит разделение смеси на отдельные ком* поненты. Так же как и в тонкослойной хроматографии, качество разделения зависит от величины коэффициен* тов распределения компонентов Rf, характеризующих от* носительную скорость их перемещения по бумаге. Для качественного разделения на бумаге значения Rf компо* нентов должны оставаться в пределах от 0,05 до 0,85.

Методика проведения анализа на хроматографической бумаге аналогична методике тонкослойной хроматогра* фии. Существует несколько ее вариантов: одномерная, двухмерная, круговая и электрофоретическая. Как и в тон* кослойной хроматографии, одномерная и двухмерная бу* мажные хроматографии выполняются с восходящим или нисходящим потоками растворителя.

Выбор подходящего растворителя является достаточ* но сложной задачей. Растворитель и анализируемые ве* щества не должны резко отличаться по полярности и гид* рофильным свойствам, иначе они или останутся на линии старта, или будут двигаться вместе с фронтом растворите* ля. Если вещество исследуемой системы остается на стар* товой линии, это свидетельствует о его малой растворимо* сти в подвижной фазе; в этом случае следует применить более полярный растворитель. Если же, наоборот, веще* ство движется вместе с фронтом растворителя (Rf = 1), то это означает, что оно слабо взаимодействует с неподвиж* ной фазой: для анализа следует выбрать неполярные рас* творители. Для сильно гидрофильных веществ применя* ют смеси растворителей с высоким содержанием воды, например, насыщенный водой вторичный бутанол, верх*

нюю фазу смеси н*бутанола, уксусной кислоты и воды (4:1:5), систему изопропанол — аммиак, 15%*ную уксус* ную кислоту.

Вещества средней гидрофильности, которые экстраги* руются из воды этилацетатом, но не экстрагируются бен* золом, хроматографируют с помощью растворителей сред* ней полярности, например бутилацетатом, хлороформом с небольшими добавками полярных веществ или воды.

Для разделения веществ малой гидрофильности, прак* тически не растворимых в воде, используют обычно в ка* честве элюентов бензол, циклогексан и т. п.

Иногда для оценки свойств веществ анализируемой смеси проводят ее предварительное хроматографирова/ ние (обычно в системе бутилацетат — вода). В зависимо* сти от установленных таким путем величин Rf анализи* руемых веществ далее выбирают либо более полярные, либо неполярные смеси.

Так же как в тонкослойной хроматографии, для де* тектирования отдельных компонентов хроматограммы об* рабатывают соответствующими реактивами, при взаимо* действии которых с компонентами анализируемой смеси образуются окрашенные соединения. Количественное оп* ределение производят путем визуального сравнения ин* тенсивности окраски или флуоресценции пятен пробы и стандартов, либо путем измерения размера пятна, пред* варительно определив зависимость между количеством ве* щества и размером его пятна на хроматограмме. Также возможно извлечение веществ из хроматографических пятен с последующим их физико*химическим анализом.

3.3. ОСАДОЧНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Осадочная хроматография — метод хромато* графии, основанный на способности разделяемых ве* ществ образовывать малорастворимые соединения с раз* личными произведениями растворимости. Метод предло* жен Е. Н. Гапоном в 1948 г.

В качестве неподвижной фазы выступает инертный но* ситель, покрытый слоем осадителя; разделяемые вещества,