КонюховХроматография

подачу и наоборот. Выходы с головок объединяются в одну линию, на которой установлен сливной клапан, перекры* тый в обычном режиме работы. Он открывается при заме* не элюента или при промывке насоса.

Поршень представляет собой сапфировый стержень; ос* новными элементами клапана являются рубиновый шарик и рубиновое седло для шарика. Камера головки изготов* лена из стали. Между поршнем и камерой есть полимер* ное уплотнение (как правило, из тефлона).

Если применяемые элюенты содержат соли, уплотне* ния рекомендуется менять каждый год. Дело в том, что кристаллики соли, оседающие при постепенном испаре* нии элюента на поршнях, шариках и седлах клапанов, могут повреждать уплотнения. Для устранения этого про* цесса в конце рабочего дня всю жидкостную систему сле* дует промыть дистиллированной водой и заполнить ее во* дой с небольшой долей органического растворителя. Если работа ведется только на водных элюентах, то на ночь сис* тему можно заполнять чистым ацетонитрилом или сме* сью ацетонитрил — вода 1:1.

Инжектор. Для ввода пробы в хроматограф обычно применяют ручной инжектор кран, фиксирующийся в двух положениях. В положении «загрузка» (load) жидкая проба c помощью аналитического шприца подается в до* зирующую петлю. В положении «ввод» (inject) жидкая проба поступает из дозирующей петли в хроматографиче* скую колонку. Инжектор находится в положении inject до введения следующей пробы.

Стандартный ручной инжектор представляет собой шестиходовой кран. Один из его выходов, находящийся на лицевой стороне, служит для подачи пробы с помощью аналитического шприца. Оставшиеся пять выходов нахо* дятся на задней стороне инжектора: два из них заняты дозирующей петлей, один ведет к насосу, другой — к ко* лонке и последний выход служит сливом избытка пробы из дозирующей петли.

В положении «загрузка» дозирующая петля выклю* чена из жидкостной системы прибора. Элюент под давле* нием поступает напрямую в колонку, что позволяет вруч*

ную при атмосферном давлении заполнить дозирующую петлю. В положении «ввод» дозирующая петля включа* ется в общую жидкостную систему, что приводит к пере* носу пробы вместе с потоком элюента на колонку.

Соединение блоков в единую жидкостную систему. Со* единение блоков хроматографа: насосной системы, инжек* тора, колонки и детектора, — осуществляют с помощью капилляров и фитингов. Капилляр для ВЭЖХ представ* ляет собой трубку с внутренним диаметром 50–300 мкм. Раньше применялись стальные капилляры, но в настоя* щее время практически везде применяют пластмассовые капилляры из PEEK (polyetherether ketone). Все соедине* ния капилляров между собой и с блоками хроматографа осуществляются при помощи специальных зажимных уплотнительных винтов — фитингов. Фитинг состоит из зажимного винта и конусообразного уплотнения — ферулы. Винт и ферула обычно изготавливаются как единое целое из РЕЕК. Такой фитинг, как правило, уплотняется вруч* ную. Если винт отделен от ферулы, то ферула выполняется из РЕЕК, а винт — из стали, под гаечный ключ. Такой фи* тинг можно аккуратно «подтянуть» гаечным ключом.

Колонка соединяется с инжектором и детектором и ка* пилляры друг с другом также при помощи капилляров и фитингов.

3.1.1.2. ДЕТЕКТОРЫ ДЛЯ ВЭЖХ

Детекторы ВЭЖХ подразделяют на селективные и уни* версальные. Селективные детекторы избирательно реги* стрируют конкретный тип соединений, которые имеют одно общее свойство, отсутствующее у других веществ, либо фиксируют изменение какого*либо физико*химиче* ского свойства растворителя, выходящего из колонки, обу* словленного наличием в нем анализируемых веществ. Это может быть изменение оптических свойств элюента (в ИК*, УФ* или видимой области), его показателя преломления, способности флуоресцировать, окисляться и т. п.

Универсальные детекторы способны регистрировать все (большую группу) соединения. Типичным примером может служить рефрактометр.

Основные требования, которым должен удовлетворять детектор (идеальный):

отклик на все вещества с прогнозируемым пределом обнаружения;

быстрый отклик на любое вещество при отсутствии ре* акции на изменение свойств подвижной фазы (ско* рость потока, состав, температура);

высокая чувствительность;

широкий линейный диапазон (105 и более);

недеструктивность;

возможность проведения количественного анализа;

простота в использовании и дешевизна.

Большинство химических соединений имеют интен* сивные полосы поглощения в диапазоне длин волн 200– 800 нм. Это обусловливает наибольшее распространение

фотометрических методов детектирования. По мень* шей мере, 65% всех смесей, исследуемых методом ВЭЖХ, содержат компоненты, поглощающие УФ*излучение на длине волны 254 нм, и для применения УФ*детекторов необходимы лишь подходящие растворители, прозрачные в указанном диапазоне. Такие детекторы характеризуют* ся высокой чувствительностью для поглощающих свет соединений, большим линейным диапазоном (около 5 по* рядков), малым рабочим объемом ячеек 1 мкл. Они неде* структивны, относительно нечувствительны к колебани* ям потока подвижной фазы и изменениям температуры, обеспечивают работу в градиентном режиме. К недостат* кам УФ*детектора можно отнести его неуниверсальность и непрозрачность некоторых подвижных фаз по отноше* нию к УФ*излучению в интересующей области длин волн.

Фотометрический детектор. Фотометры (обозначают* ся аббревиатурой УДФ) наиболее дешевые и простые по конструкции (рис. 58), применяются в ВЭЖХ для выпол* нения массовых анализов. Источником света является ртутная лампа низкого давления; детектирование прово* дится на длине волны 254 нм, которой соответствует 90% энергии излучения лампы. Свет от источника излучения проходит через рабочую микрокювету, в которую из хро* матографической колонки поступает поток элюента, и

Рис. 58

Принципиальная оптическая схема фотометра:

1 — фотоприемник; 2 — рабочая кювета; 3 — фильтр; 4 — ртутная лампа; 5 — кювета сравнения.

микрокювету сравнения. Сигналы от обоих фотоприем* ников сравниваются, их разница во времени дает на хро* матограмме пик.

Кроме рассмотренных детекторов с фиксированной длиной волны нашли применение и другие фотометры:

детекторы с дискретно изменяемой с помощью опти* ческих фильтров длиной волны (иначе — фильтровые фотометры, ФУФД);

спектрофотометрические детекторы с плавно изменяе* мой длиной волны, предназначенные для регистрации поглощения в определенной области УФ*спектра (при* нятая аббревиатура — СПФ);

спектрофотометрические детекторы на фотодиодных линейках (иное название — спектрофотометрические детекторы на диодных матрицах, СПФ ДМ, или про*

ще, ДМД).

Рефрактометрический детектор. Является универсаль* ным детектором в жидкостной хроматографии и совмес* тим практически с любой подвижной фазой. Это недест* руктивный концентрационный детектор. Он непрерывно регистрирует изменения показателя преломления элюата на выходе из колонки. В свою очередь, показатель пре* ломления меняется пропорционально изменению концен* трации растворенного вещества. Рефрактометр широко применяется в хроматографическом анализе и особенно полезен в тех случаях, когда анализируемые вещества не поглощают в УФ*области спектра, не обладают флуорес* ценцией и электрохимической активностью. Поскольку рефрактометр реагирует на весь поток в целом, он облада* ет меньшей чувствительностью по сравнению со спектро*

Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

скопическими или электрохимическими детекторами. Это детектор средней чувствительности. Чувствительность мо* жет быть повышена за счет правильного выбора подвиж* ной фазы, а именно — при использовании элюента с очень высоким или очень низким показателем преломления.

Показания рефрактометрического детектора в значи* тельной степени зависят от колебаний параметров, влияю* щих на свойства подвижной фазы: температуры, концен* трации анализируемого вещества, пульсаций потока под* вижной фазы (флуктуации потока не должны превышать 0,01 см3/мин на выходе из колонки), давления. Сущест* вуют рефрактометрические детекторы трех типов.

Рефрактометр оптического отклонения (наиболее распространен). Луч света проходит через кювету, содер* жащую две ячейки (рабочую и сравнительную), заполнен* ные жидкостями с различными показателями преломле* ния, при этом луч отклоняется на угол, пропорциональ* ный разности этих показателей преломления. Если же показатели преломления жидкостей в обеих ячейках кю* веты одинаковы, отклонения луча не происходит. Преиму* ществами детектора являются широкий диапазон линей* ности и малый объем ячеек (10 мкл).

Рефрактометр Френеля. Луч света падает на поверх* ность раздела двух оптических сред. Количество света, от* раженного от поверхности раздела двух фаз (жидкость/ стекло), пропорционально разности показателей прелом* ления и углу падения света на поверхность раздела. Если угол падения подобрать таким образом, чтобы угол про* никновения был 90 (т. е. близок к полному углу отраже* ния), то небольшие изменения показателя преломления приведут к значительным изменениям интенсивности от* раженного луча. Вместимость кювет составляет 3–5 мкл, т. е. возможна работа при небольших расходах элюента. Рефрактометр Френеля наиболее чувствителен к пульса* циям потока, имеет меньший линейный диапазон. Высо* кие требования предъявляются к чистоте стекол.

Интерферометр. Коэффициент преломления измеря* ется методом интерференции света. Интерферометр име* ет две проточные кюветы объемом 5 мкл. Чувствитель*

ность и линейный диапазон в несколько раз больше, чем у других моделей. Предел обнаружения анализируемых ве* ществ 3 мкг/мл.

Флуориметрический детектор. Используется для ана* лиза флуоресцирующих веществ. В тех случаях, когда сам по себе образец не флуоресцирует, на колонке можно до или после разделения исследуемого образца получить его флуоресцирующие производные. Чувствительность флуо* риметров в 100 раз превышает чувствительность УФ*де* текторов, однако линейный диапазон для них более уз* кий 104.

В качестве источников излучения обычно используют газоразрядные лампы: ртутная ( = 254 нм), цинковая ( = 214 и 308 нм).

Электрохимические детекторы. Различают электро* химические детекторы, которые реагируют либо на из* менение свойств элюента, либо на свойства конкретного анализируемого соединения. К первому типу относится кондуктометрический детектор, ко второму — амперо* метрические детекторы. Большинство электрохимиче* ских детекторов работают в амперометрическом режиме, при котором поддерживается постоянное напряжение ме* жду двумя электродами, погруженными в поток элюента, и регистрируется зависимость силы тока от времени.

Кондуктометрический детектор. Электрическая проводимость раствора зависит от числа (концентрации) ионов — именно эта зависимость и положена в основу ра* боты кондуктометрического детектора. Для подавления электрохимических реакций на поверхности электродов используют переменный ток с частотой от 50 до 1000 Гц и напряжением от 5 до 10 В. Измерения проводят с приме* нением моста сопротивлений Уитстона. Детекторы дан* ного типа наиболее пригодны для определения заряжен* ных соединений в элюате, предпочтительны при анализе малых концентраций ионов.

Вольтамперометрический детектор. Суть вольтам* перометрического детектирования заключается в измере* нии электрического тока в ячейке, возникающего при окислении (восстановлении) регистрируемого вещества на

поверхности рабочего электрода при подаче на него опре* деленной разности потенциалов. Этот детектор обладает высокой чувствительностью, сравнимой с чувствительно* стью флуоресцентных детекторов. Кроме того, он высоко* селективен, поскольку не все вещества легко окисляются или восстанавливаются на электродах.

Вольтамперометрический детектор используют при анализе веществ, обладающих электрохимической актив* ностью, т. е. способностью при определенном потенциале окисляться или восстанавливаться. Вещества, содержа* щие фенольную, индольную или альдегидную группу, спо* собны окисляться при низких потенциалах (0,4–0,7 В). В качестве рабочего электрода используют электроды из платины, золота, углеродной пасты, графита. Электрод, на котором протекает интересующая нас реакция, и явля* ется рабочим электродом. Электрохимические детекторы работают только с проводящей водной подвижной фазой, поэтому они более подходят для обращеннофазной или ионообменной хроматографии. Для увеличения проводи* мости подвижной фазы в водный элюент добавляют нит* рат калия, перхлорат натрия, а в органический — перхло* рат тетраэтиламмония.

Для каждого класса соединений характерно свое на* пряжение разложения, следовательно, меняя напряже* ние, можно сделать детектор высокоселективным.

3.1.1.3.ВЭЖХ С ГРАДИЕНТОМ СОСТАВА РАСТВОРИТЕЛЯ

При разделении сложных смесей веществ, особенно биологического и природного происхождения, подобрать сорбент и растворитель, которые обеспечивали бы разде* ление вcex или большинства веществ, обычно не удается. Задачу часто удается решить, применяя растворитель, элюирующая сила которого в процессе хроматографиро* вания увеличивается.

Дело в том, что адсорбция из растворов зависит не толь* ко от природы адсорбата и адсорбента, но и от природы растворителя. Чем сильнее по полярности отличаются ад* сорбент и растворитель, тем сильнее адсорбция (правило

выравнивания полярностей Ребиндера). Например, из* вестно, что адсорбция спиртов из водных растворов на гра* фитированной саже велика, но при замене воды на бензол может наблюдаться даже отрицательная Гиббсова адсорб* ция Г. Следовательно, можно менять порядок выхода ком* понентов из колонки с одной и той же неподвижной фа* зой, изменяя природу растворителя — подвижной фазы.

Например, при разделении веществ на полярной фазе, можно уменьшить их время удерживания, увеличив по* лярность подвижной фазы. И, наоборот, увеличить их вре* мя удерживания, уменьшив полярность подвижной фазы.

Аналогично программированию температуры (в газо* вой хроматографии), в жидкостной хроматографии при градиентной подаче состав растворителя непрерывно ме* няется так, чтобы по мере выхода слабо удерживаемых компонентов, уменьшить коэффициент распределения и тем самым ускорить выход сильно удерживаемых. Это приводит к тому, что как слабо, так и сильно удерживае* мые вещества выходят из колонки за приемлемо корот* кое время, при этом зоны сильно удерживаемых соедине* ний сужаются и дают более узкие и симметричные пики. В настоящее время популярность градиентного элюирова* ния несколько уменьшилась, однако для многих объек* тов анализа это единственно приемлемый вариант реше* ния задачи разделения компонентов смеси.

Хроматографдляградиентнойхроматографии(ГВЭЖХ), как видно из самого определения, должен иметь устрой* ство для изменения состава растворителя по заданной ис* следователем программе. Это достигается тем, что каж* дый из растворителей (сильный и слабый) подается своим насосом с переменной скоростью так, чтобы элюирующая сила смеси увеличивалась во времени. То есть помимо обычных узлов в хроматографе появляются дополнитель* но программатор (устройство формирования градиента) и управляемые им система клапанов и смеситель. Этим обусловлен первый недостаток ГВЭЖХ — приборы для нее примерно вдвое дороже, чем для изократической ВЭЖХ.

Кроме того, в состав системы для ГВЭЖХ добавляют дорогое устройство для эффективной дегазации раствори*

телей. Это связано с тем, что при смешении плохо дегази* рованных растворителей всегда выделяются пузырьки, так как растворимость воздуха в смеси растворителей обычно меньше растворимости его в чистых компонентах. Пузырьки газа могут попасть в клапанную систему, в на* сос и нарушить их работу.

Вызывает также затруднение полное смешение силь* ного и слабого растворителей, поступающих в смеситель. Неоднородность же потока вызывают заметное увеличе* ние шумов детектора.

Наконец, при градиентном элюировании практически исключается использование рефрактометрического детек* тора, так как изменение показателя преломления при из* менении состава растворителя приводит к нарушению его работы.

Выбор сорбента и колонки для ГВЭЖХ также имеет свои особенности. Прежде всего, сорбент должен быстро приходить в равновесие с растворителем постоянно из* меняющегося состава как в процессе градиентного элюи* рования, так и при возвращении к исходному составу рас* творителя при подготовке колонки к новому анализу. Время, необходимое для установления равновесия для ка* ждого сорбента, определяется экспериментально по дос* тижению постоянства времени удерживания веществ, входящих в анализируемую смесь. Это время различно как для разных сорбентов, так и для разных по составу растворителей, и может колебаться от десятков до не* скольких сотен минут.

Наконец, при ГВЭЖХ очень важно правильно выбрать растворитель и добавки в него. Обычно зависимость удер* живания от состава элюента (от концентрации добавки) описывают уравнением Скотта:

1/VR = A + B Сдоб,

где VR — удерживаемый объем; Сдоб — концентрация до* бавки в элюенте; А, В — эмпирические коэффициенты.

Если при изократической ВЭЖХ небольшие примеси, присутствующие в растворителе, приходят в равновесие с сорбентом и обычно не дают ложных пиков или увеличе*

ния шума детектора, то в ГВЭЖХ требования к чистоте растворителей значительно более жесткие.

Например, в случае использования воды, недостаточ* но очищенной от органических примесей, присутствую* щих в природной воде или привнесенных в нее в процессе ионообменной очистки, при элюировании проб метаноль* но*водным или ацетонитрильно*водным градиентным рас* творителем могут появляться ложные пики.

Влюбом случае растворители для ГВЭЖХ должны иметь марки чистоты «Для УФ*спектроскопии» или «Для жидкостной хроматографии». Примеси, находящиеся в метаноле или ацетонитриле, точно так же могут накапли* ваться в колонке и проявляться в виде пиков при градиент* ной подаче элюента.

Единственным путем установления пригодности рас* творителей для ГВЭЖХ служит их испытание в реальных условиях хроматографирования с градиентной подачей растворителя требуемого состава, но без введения анали* зируемых веществ (холостой градиент).

Взаключение отметим, что к градиентному элюирова* нию следует прибегать только в тех случаях, когда его при* менение является единственным путем решения анали* тической задачи. Если же предварительные исследования показали, что возможно использовать изократический ва* риант хроматографии, следует перейти к нему.

3.1.1.4.НЕПОДВИЖНАЯ ФАЗА ВЭЖХ

Коэффициент диффузии D веществ в жидкости на че* тыре*пять порядков меньше, чем в газах (см. табл. 11). По* этому для интенсификации массообменных процессов ме* жду подвижной и неподвижной фазами применяют час* тицы неподвижной фазы малого размера (3–5 мкм). При этом для уменьшения пути диффузии анализируемых ве* ществ в потоке растворителя следует добиваться того, что* бы зерна были бы как можно плотнее упакованы.

В зависимости от природы неподвижной фазы в ВЭЖХ различают следующие ее варианты.

1. Адсорбционная ВЭЖХ. Разделение в адсорбционной жидкостной хроматографии осуществляется в результате