УП- Биоорганическая химия

Перенос кислорода в кровяном русле осуществляет другой белок – гемоглобин,

четырехсубъединичный белок (пара альфа- и пара бета-цепей), каждая субъединица которого содержит гем, так что в целом гемоглобин может присоединять 4 молекулы кислорода. Пространственная структура субъединиц гемоглобина в целом похожа на структуру миоглобина и организована в основном α-спиралями. Гемоглобин является примером сложного, многосубъединичного глобулярного белка, который выполняет транспортную функцию – он переносит кислород из легких к тканям и углекислый газ в обратном направлении.

Важнейшей функцией, которую выполняют белки, является каталитическая. Белки,

выполняющие эту функцию, называются ферментами или энзимами (от англ. enzyme).

Это слово происходит от латинского fermentum, что означает «закваска» (первые выделенные ферменты участвовали в процессах брожения). Громадное разнообразие жизненно необходимых реакций самопроизвольно протекает в организме с очень малой скоростью. Благодаря каталитическому участию ферментов эти процессы ускоряются в миллионы раз. Подробно о ферментах и механизме их реакций вы узнаете в курсе

«Биохимия». Здесь же мы отметим несколько характерных свойств ферментов,

отличающих их от химических катализаторов.

1.Ферменты, также как и неорганические катализаторы, снижают энергию активации реакций, т.е. снижают энергетический барьер реакции. Их катализ позволяет увеличить скорость реакций в 106-1012 раз.

2.Ферменты проявляют высокую специфичность к реагирующим молекулам,

которые называются субстратами. Субстраты присоединяются к ферментам в строго определенном месте с особой пространственной структурой, которое называется

активный центр фермента. Такое объединение молекул называется фермент-

субстратный комплекс.

3. Ферменты активны в мягких условиях реакции – при рН 6-8, температуре 35-45 С,

нормальном давлении.

Еще раз подчеркнем, что функциональная активность белка напрямую зависит от его правильной пространственной структуры. Неправильное свертывание белков может являться причиной или одной из причин серьезного заболевания. Такие заболевания как диабет 2-го типа, болезнь Альцгеймера, кистозный фиброз, всем известная губчатая энцефалопатия («коровье бешенство»), а также болезнь куру и скрепи (почесуха овец)

51

связаны напрямую с неправильным фолдингом определенных белков, причины и механизмы которого до сих пор до конца не установлены.

Общедоступных ресурсов, содержащих информацию об установленных пространственных структурах различных белков, в настоящее время в Интернете несколько, вот их адреса:

Protein Data Bank (PDB): http://www.rcsb.org/

Nucleic Acid Databank: http://ndbserver.rutgers.edu/

Molecular Modeling Database (MMDB): http://www/ncbi.nlm.nih.gov/Structure/index.shtml

Каждой структуре в банке PDB присвоен индивидуальный код, так называемый PDB ID. Коды белков, которые мы рассмотрели – обелина, GFP и миоглобина человека,

приведены в подписи к рисункам 1.21-1.24.

1.4Определение первичной структуры белка

Свойства белков и их биоспецифическая активность непосредственно связаны с их пространственной структурой, а та, в свою очередь, определяется первичной структурой полипептидной цепи – т.е. количеством и составом входящих в нее аминокислотных остатков, а также их последовательностью. Поэтому установление первичной структуры белка – важнейшая задача экспериментальной биоорганической химии и биохимии.

Работа включает следующие этапы:

1.Выделение белка из биологического материала в индивидуальном виде;

2.Определение его молекулярной массы и субъединичного состава;

3.Определение аминокислотного состава белка;

4.Определение концевой аминокислоты (чаще с N-конца);

5.Направленная деградация белка с получением более коротких фрагментов;

6.Определение аминокислотной последовательности (секвенирование) каждого фрагмента;

7.Сборка фрагментов и установление последовательности исходного белка.

Кнастоящему времени разработано множество методов, позволяющих успешно справиться с этой задачей. Рассмотрим некоторые из них в соответствии с каждым из вышеперечисленных этапов.

Этап 1. Получение белка в высокоочищенном виде из биологического материала

(биомассы бактерий, ткани растений или животных) основано на различии в свойствах разных белков – растворимости, заряде, молекулярной массе, а также их специфичном

52

взаимодействии. Ниже описаны основные физические и физико-химические методы,

которые используют для выделения и очистки белка.

А). Дезинтегрирование (разрушение) исходного материала и получение экстракта,

содержащего целевой белок. Для этого используют различные ножи, гомогенизаторы,

ультразвуковую обработку. Полученную массу обрабатывают водным буферным раствором с определенным значением рН для перевода целевого белка в раствор.

Полученную массу разделяют с помощью фильтрования либо центрифугирования на две фракции – раствор, содержащий смесь водорастворимых белков, и осадок.

Б). Для разделения белков часто используют процедуру осаждения белков из полученного раствора добавлением нейтральной соли, например, сульфата аммония

(NH4)2SO4, который хорошо растворяется в воде (при 0 С его максимальная концентрация составляет 3,9 М) и практически не меняет рН раствора. Добавление солей увеличивает ионную силу раствора, что приводит к осаждению белков благодаря их гидрофобным свойствам. Часто этот способ называют высаливанием. Добавление солей проводят порциями, постепенно увеличивая ионную силу раствора, и после каждого добавления полученный осадок отделяют центрифугированием. В

зависимости от гидрофобных свойств белки осаждаются при разной ионной силе, и

полученные осадки содержат разные белки. Далее каждый осадок растворяют и определяют тот, в котором содержится целевой белок, по его специфической активности. Остальные осадки отбрасывают.

В). Как правило, полученная после сульфат-аммонийного осаждения фракция помимо целевого белка содержит еще и примесные. Для последующей очистки используют

хроматографические методы. Хроматография – это метод разделения веществ, в

основе которого лежит взаимодействие вещества, находящегося в подвижной фазе

(жидкость или газ) с поверхностью неподвижной фазы (например, адсорбентом). В

результате процесса вещества распределяются, образуя отдельные зоны – фракции, в

каждой из которых в идеале содержится только одно вещество из исходной смеси (Рис.

1.25).

Основы хроматографии как способа разделения веществ были заложены русским ботаником Михаилом Семеновичем Цветом (1872-1919), который изучал пигментный состав растительного листа. Цвет заметил, что при пропускании экстракта листа через стеклянную колонку, заполненную сорбентом (он использовал карбонат кальция – СаСО3)

исходно бурый экстракт образует зоны, окрашенные в различные цвета – от оранжево53

красного до зелено-бурого. Отсюда произошло слово «хроматография», оно образовано от греческого chroma – цвет и grapho – писать. В полученных Цветом зонах содержались хлорофиллы a, b, c и ряд ксантофиллов.

В настоящее время хроматография является одним из самых мощных и широко применяемых методов разделения веществ. По типу взаимодействия веществ с неподвижной фазой различают ионообменную, адсорбционную, аффинную и эксклюзионную хроматографии. При этом колонка заполняется нерастворимыми частицами (как правило, шарообразными), на поверхности которых иммобилизованы группы, способные обратимо адсорбировать молекулы из раствора (адсорбент, Рис. 1.25),

либо иммобилизовать их по принципу ионного взаимодействия (ионообменник, Рис. 1.25)

или биоспецифического сродства (аффинный сорбент).

Рис. 1.25. Принцип хроматографического разделения веществ.

По технике проведения хроматографического процесса выделяют тонкослойный,

колоночный (показан на Рис. 1.25) и капиллярный типы хроматографии.

По агрегатному состоянию неподвижной и подвижной фаз – твердо-жидкофазную,

жидко-жидкофазную, газо-адсорбционную и газожидкостную хроматографию.

54

Хроматографические методы используют как для выделения вещества, так и для подтверждения чистоты полученного препарата – наличие на хроматограмме

(графическом изображении хроматографического процесса) единственной полосы, зоны или пика может свидетельствовать об его индивидуальном составе.

В рамках нашего курса мы будем обращаться к этому методу неоднократно.

Этап 2. Для определения молекулярной массы белка применяют ряд методов, таких как эксклюзионная хроматография, гель-электрофорез и масс-спектрометрия.

В основе эксклюзионной хроматографии (часто ее называют гель-фильтрацией)

лежит различие проницаемости молекул разделяемых веществ в частицы неподвижной фазы, которые представляют собой гранулы геля с порами разного размера. Для проведения такой хроматографии используют как правило длинные колонки малого диаметра, заполненные суспензией нерастворимого геля. Крупные молекулы не проникают в поры геля и быстро двигаются по колонке между его гранулами, молекулы среднего и малого размера задерживаются в порах, соответствующих их размеру и продвигаются по ней вместе с растворителем существенно медленнее. Таким образом,

происходит разделение молекул в соответствии с их молекулярной массой. Колонку с гелем калибруют с помощью растворов веществ с известной массой, далее соотносят время выхода исследуемого вещества и определяют его массу.

В основе гель-электрофореза лежит способность заряженной молекулы двигаться в постоянном электрическом поле в определенном направлении в соответствии с ее зарядом

(Рис. 1.26). В качестве носителя для проведения электрофореза применяют нерастворимые гели (агарозу или полиакриламид) с определенным размером пор. В ходе электрофореза крупные заряженные молекулы продвигаются в сетке геля медленнее, а мелкие – быстрее.

В результате молекулы одинакового размера образуют общие зоны, соответствующие их молекулярной массе. Так же как и при гель-хроматографии, электрофорезные гели калибруют с помощью смеси молекул с известной массой и используя полученные калибровочные кривые установливают размер молекул исследуемого вещества. Гель-

электрофорез применяют не только для определения молекулярной массы отдельного вещества, но и для определения чистоты полученного препарата: если в образце имеются примесные белки, то на картинке электрофореза будут наблюдаться несколько зон или полос.

Перечисленные методы применяют, в том числе, и для определения

субъединичного состава молекулы исследуемого белка. Для этого гель-фильтрацию или

55

Рис. 1.25. Гель-электрофорез. В карманы гелевой пластины вносят растворы анализируемых образцов и подключают постоянное электрическое поле. Белки движутся в соответствии с зарядом, и длина пробега зависит от размера молекул. На картинке внизу показан пример электрофоретического разделения образцов в процессе выделения рекомбинантного гибридного белка обелин-GFP. В карманы геля нанесены: 1 – раствор белков с известной молекулярной массой, значение которой указано слева; 2 – смесь, содержащая помимо целевого белка цитоплазматические белки бактерий E. coli; 3 – целевой белок, выпавший в осадок при экспрессии в клетках; 4 – белки цитоплазмы; 5 – гибридный белок после очистки; 6 – чистый обелин; 7 – чистый GFP. Молекулярную массу гибридного белка можно определить по пробегу стандартных белков: она примерно равна сумме молекулярных масс обелина и GFP.

электрофорез проводят в нативных, а также денатурирующих условиях, вызывающих

диссоциацию субъединиц.

Мощным современным инструментом для определения молекулярной массы вещества

является масс-спектрометрия. В основе этого метода лежит способность заряженных

частиц двигаться в магнитном поле. Траектория продвижения зависит от массы частицы,

56

точнее от соотношения ее массы к заряду. На рисунке 1.27 схематически представлен принцип этого метода. Ионизация (т.е. приобретение заряда) молекул вещества происходит в условиях вакуума, в специальной камере с помощью бомбардировки потоком высокоактивных электронов. Далее пучок заряженных частиц попадает в постоянное (или переменное, в зависимости от особенностей конструкции) магнитное поле, где ионы будут двигаться по искривленной траектории, радиус которой зависит от их массы. Траектория ионов фиксируется специальными датчиками с очень большой разрешающей способностью.

Масс-спектрометрия получила мощное развитие и широкое распространение в последние годы. С ее помощью не только определяют молекулярную массу вещества, но и проводят его идентификацию. Дело в том, что бомбардировка молекулы высоко активными электронами приводит к ее частичной деградации с образованием заряженных

Рис. 1.27. Принципиальная схема масс-спектрометрического анализа вещества.

осколков. Характерный профиль этих осколков позволяет определить структуру молекулы

(накоплена громадная база данных) или установить структуру элементов, входящих в ее состав.

Однако для установления молекулярной массы белков, особенно крупных, этот метод как правило не используют.

Этап 3. После получения образца белка в высокоочищенном виде часто определяют его аминокислотный состав, т.е. какие аминокислоты и в каком количестве входят в его состав. Для этого белок подвергают полному гидролизу до свободных аминокислот (как правило, это инкубирование в 6 М HCl при 106ºС), а затем полученный гидролизат

анализируют с помощью колоночной хроматографии. Для идентификации по оптической

57

плотности все аминокислоты переводят в окрашенные соединения реакцией с

красителями, например с нингидрином.

Современные биотехнологические фирмы поставляют на рынок аминокислотные

анализаторы, работающие по этому принципу и позволяющие быстро установить

аминокислотный состав любого белка. На рисунке 1.28 показан такой прибор, основные

узлы и пример хроматограммы.

Рис. 1.28. Вверху: жидкостной хроматограф KNAUER (Германия). Блок-схема его устройства. Внизу: пример хроматограммы, полученной при определении аминокислотного состава экстракта бактериальных клеток.

58

Этап 4. Определение концевой аминокислоты проводят с помощью направленной химической модификации. Часто для этого применяют реакцию N-концевой аминогруппы с дансилхлоридом (Рис. 1.29, реакция 1) либо С-концевой карбоксильной группы с динитрофторбензолом (Рис. 1.29, реакция 2) с последующим полным гидролизом белка до аминокислот. Полученный лизат хроматографируют и определяют, какая из аминокислот содержит дансильный либо динитрофенильный остаток: дансильные производные аминокислот (ДНС-ак) обладают флуоресценцией (т.е. способностью светиться в ответ на световое облучение), а динитрофенильные (ДНФ-ак) – интенсивной желтой окраской.

Обратите внимание, если при такой обработке получаются две или более разных аминокислоты, это может означать, что белок состоит из нескольких субъединиц.

Этап 5. Для упрощения процесса секвенирования крупных белковых молекул их расщепляют на более мелкие фрагменты. Направленную деградацию молекулы белка проводят с помощью специфических химических реагентов либо ферментов – протеаз,

расщепляющих полипептидную цепь в строго определенных участках. Например,

бромциан – BrCN, расщепляет полипептид только по метиониновым остаткам, а фермент трипсин – только по аминокислотам оснóвного характера – лизинам либо аргининам. То есть в случае применения бромциана, все полученные фрагменты будут оканчиваться на аминокислоту метионин, а в случае трипсина – на лизин либо аргинин. Полученные таким образом мелкие пептиды разделяют с помощью хроматографии и секвенируют по отдельности.

Этап 6. Для секвенирования полученных фрагментов их обрабатывают фенилизотиоцианатом (Рис. 1.29, реакция 3). Этот реагент взаимодействует с аминогруппой на N-конце молекулы с отщеплением концевой аминокислоты, другие аминокислоты и пептидные связи при этом не затрагиваются. Полученное фенилтиогидантоиновое (ФТГ) производное концевой аминокислоты идентифицируют с помощью хроматографии. Далее реакцию повторяют с уже укороченным на одну аминокислоту полипептидом и идентифицируют следующую аминокислоту. Процесс повторяют до тех пор, пока не устанавливают последовательно все аминокислотные остатки, входящие в состав фрагмента. Аналогично секвенируют другие фрагменты белка.

Этот способ секвенирования был разработан в 50-х годах прошлого века шведским биохимиком П.В. Эдманом и носит его имя. В некоторых технологиях исходный анализируемый пептид иммобилизуют на какой-либо поверхности. После реакции с фенилизотиоцианатом отщепленная ФТГ-аминокислота переходит в раствор для

59

Рис. 1.29. Определение первичной структуры полипептида. 1), 2) реакции для определения С-концевой и N-концевой аминокислот, соответственно; 3) схема реакций при секвенировании по Эдману.

60