3.5.2. Определение аминного азота с нингидрином

Метод, основанный на декарбоксилировании аминокислот с нингидрином, является достаточно точным, так как в отличие от большинства методов не зависит от содержания в сусле пептидов. Нингидрин окисляет α-аминокислоты при рН 2,5 до аммиака, диоксида углерода, альдегида. Содержание α-аминного азота рассчитывают по количеству выделившегося диоксида углерода.

Реактивы, необходимые для проведения анализа:

– 0,1 н. раствор гидроксида бария (17 г Ва(ОН)₂∙8Н₂О и 29 г ВаСl₂ ∙ 2Н₂О растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды, нагревают до кипения и отфильтровывают через бумажный фильтр, титр проверяют по 0,1 н. раствору НСl ежедневно);

– цитратный буферный раствор с рН 2,5 (2,06 г тринатрийцитрата и 19,5 г лимонной кислоты растирают в ступке и растворяют в дистиллированной воде в колбе вместимостью 1 дм³);

– нингидрин.

Ход определения. Прибор для определения α-аминного азота (рис. 3.3) состоит из двух плоскодонных колб вместимостью 50 см³, закрывающихся шлифованными пробками с трубками, немного не доходящими до дна колбы, мембранного насоса, подающего 1000 см³ воздуха в минуту. Шлифы смазывают вакуумным силиконовым жиром или вазелином. Насос и колбы соединяют шлангами в замкнутую систему.

В реакционную колбу 3 последовательно вносят 30 см³ сусла, одну каплю пеногасителя и 600 мг цитратного буферного раствора (рН 2,5). Для удаления диоксида углерода, содержащегося в этой смеси, колбу выдерживают 10 мин на кипящей водяной бане, встряхивая колбу через каждые 2 мин. Затем колбу переносят в водяную баню с температурой 0 С, выдерживают 5 мин и вносят в нее 1…1,5 г нингидрина.

Рис. 3.3. Прибор для определения α-аминного азота

В колбу 1 наливают 25 см³ 0,1 н. раствора гидроксида бария, закрывают ее шлифованной пробкой, после чего колбы соединяют трубками.

Колбу с реакционной смесью ставят на кипящую водяную баню и включают мембранный насос 2. После начала окрашивания смеси колбу выдерживают в бане 20 мин, затем снимают трубки и выключают насос.

Диоксид углерода, выделившийся в результате окисления α-ами-нокислот и количественно эквивалентный α-аминному азоту сусла, в колбе 1 вступает в реакцию с гидроксидом бария. Методом обратного титрования оставшегося гидроксида бария можно рассчитать количество α-аминного азота.

В плоскодонную колбу вместимостью 300 см³ переливают содержимое колбы 1. Колбу 1 ополаскивают дистиллированной водой, освобожденной от диоксида углерода. Неиспользованный гидроксид бария оттитровывают 0,1 н. раствором НСl, используя в качестве индикатора фенолфталеин.

Для исключения погрешности определяют поправку на реактивы, для чего повторяют весь анализ, используя вместо 30 см³ сусла дистиллированную воду. Для повышения точности анализа находят содержание азота аспарагиновой кислоты ферментативным способом.

Содержание α-аминного азота в сусле (А, мг/дм³)

, (3.6)

где a – объем 0,1 н. раствора НСl, пошедшего на титрование 25 см³ 0,1 н. раствора гидроксида бария, см³; b – объем 0,1 н. раствора НСl при определении поправки на реактивы, см³; c – объем 0,1 н. раствора НСl, пошедшего на обратное титрование, см³; g – объем пробы, см³; e – количество азота аспарагиновой кислоты, мг/см³.