Тема7 токсикология фосфорорганических соединений

Работа 1. Ферментный метод определения фосфорорганических пестицидов в патологическом материале

Материальное оснащение: баня водяная, термометр химический до 100 °С, пробирки, колбы мерные на 100 и 50 мл, пипетки по 0,2-10 мл отдельно для каждого реактива, склянки с притертыми проб­ками, химические стаканы, весы, вата.

Принцип метода. В основу метода положена способность фос­форорганических соединений (ФОС) угнетать холинэстеразу. Основ­ное значение этого фермента разложение избытка ацетилхолина на холин и уксусную кислоту. Последняя в ходе реакции изменяет окраску индикатора бромтимолового синего до зеленого цвета. При угнетении фермента замедляется расщепление ацетилхолина, и образование ук­сусной кислоты в реакционной смеси происходит в течение дли­тельного времени, что устанавливают по скорости изменения окраски индикатора.

О наличии пестицидов в пробе судят по степени угнетения ак­тивности холинэстеразы, выраженной в процентах. Расчет проводят по калибровочному графику. Чувствительность метода 0,1 мг/кг анализи­руемого продукта. Точность метода 80%. Метод рекомендуется для определения хлорофоса, метафоса, карбофоса, трихлорметафоса-3, ме-тилнитрофоса, метилмеркаптофоса, ДДФВ и диброма в органах и тканях животных.

Подготовка материала к исследованию. Исследуемый материал тщательно измельчают, после чего навеску в 20-30 г помещают в стаканчик с притертой пробкой, заливают адекватным количеством хлороформа (20-30 мл), закрывают пробкой и экстрагируют в течение часа при периодическом встряхивании. Затем пипеткой, нижний конец которой обернут ватой, набирают 1 мл хлороформенного экстракта и переносят в пробирку (или химический стаканчик). В другую конт­рольную пробирку (или химический стаканчик) вносят 1 мл хлоро­форма. Обе пробирки помещают на водяную баню при температуре не выше 40 °С или под струю воздуха до полного испарения хлорофор­ма. К сухому остатку обе пробирки добавляют по 1 мл дистиллиро­ванной воды и снова помещают пробирки на водяную баню на 3 мин. После этого охлаждают до комнатной температуры.

Ход опыта. В опытную (№ 1) и контрольную (№ 2) пробирки вносят по 1 мл раствора холинэстеразы или сыворотки крови лошади. Затем в пробирку № 1 добавляют экстракт из патматериала, а в про­бирку № 2 - дистиллированную воду. Содержимое хорошо переме­шивают и ставят на водяную баню при температуре 39-40°С на 30 мин. По истечении этого времени в пробирку № 3 вносят 0,5 мл содержимого из опытной пробирки № 1, а в контрольную пробирку (№ 4) - 0,5 мл из контрольной (№ 2). В каждую пробирку приливают по 4,5 мл раствора № 3 и сразу отмечают время начала реакции. Затем в отдельную пробирку (№ 5) помещают 0,5 мл содержимого из конт­рольной пробирки (№ 2) и добавляют 4,5 мл раствора № 2 Эта про­бирка является колориметрическим стандартом (см. схему) В даль- нейшем отмечают время уравнения (в минутах) цвета жидкости в опытной и контрольной пробирках с цветом колориметрического стандарта. Процент угнетения активности холинэстеразы вычисляют по формуле:

где X - угнетение активности холинэстеразы, %;

В - время уравнения цвета жидкости в контрольных пробирках с

цветом стандарта;

в - время уравнения цвета жидкости в опытных пробирках с цве­том стандарта.

Схема определения активности холинэстеразы

Наименование компонентов	Номера пробирок
	1 опыт	2 опыт	3 опыт	4 контроль	5 колорим. стандарт
Экстракт из патологического материала	] МЛ	-	—	-	-
Дистиллированная вода	-	1 мл	-	_	_
Сыворотка крови лошади I : 3	1 мл	1 мл	-	_	_
Инкубация при 40 "С в течение 30 мин.	+	+	—	-	-
Содержимое пробирки № 1	-	-	0,5мл	_	_
Содержимое пробирки № 2	-	-	, _	0,5мл	0,5мл
Раствор № 3	-	-	0,5мл	4,5мл	-
Раствор № 2	-	-	-	-	4,5мл
Инкубация при 38-39 °С до урав­нения цвета	—	—	+	+	+

Угнетение активности холинэстеразы на 10% и более свиде­тельствует о наличии ФОС в исследуемом материале.

Количественное определение ФОС проводят по калибровочному графику, построенному по препарату, наличие которого предполага­ется в исследуемом материале. Если подозревается незвестное ФОС, то калибровочный график строят по одному из ядохимикатов, пере­численных выше. Для этого необходимо иметь химически чистое ве­щество или препарат с известным содержанием активно действующего вещества (ДВ). Из заведомо чистого образца исследуемого материала (мышцы, орган или другой образец) в склянки с притертыми пробками берут 5 навесок по 10 г и вносят в них соответственно 1,0; 5,0; 10,0; 20,0; 50,0 мкг препарата по ДВ. Через 30 мин. каждую навеску за­ливают 10 мл хлороформа и экстрагируют один час. Хлороформенные экстракты исследуют в описанном выше порядке. По оси ординат откладывают процент угнетения активности холинэстеразы в каждой

пробе, а по оси абсцисс-количество препарата (в мг/кг) по ДВ. Зави­симость процента угнетения активности холинэстеразы от концент­рации ФОС в исследуемом материале (примерный калибровочный гра­фик) представлена в таблице.

Угнетение активности холниэстеразы в зависимости от содержания хлорофоса в молоке (мг/л) __

Концентрация хлорофоса, мг/л	Угнетение активности холинэстеразы, %
0,050	3,1
0,075	21,0
0,100	32,6
0,125	37,0
0,150	40,5
0,175	44,0
0,200	47,0
0,225	50,0
0,250	53,0
0,275	55,0
0,300	57,5
0,325	60,5
0,350	62,5
0,375	65,5
0,400	67,5
0,450	71,0
0,475	72,0
0,500	74,7

Работа 2. Токсическое действие хлорофоса и лечение отравления

Материальное оснащение: кролик, шприцы, вата, спирт 10%-ный раствор хлорофоса, 0,1.%-ный раствор атропина сульфата.

Ход опыта. Кролику ввести под кожу в области спины 10%-ньн раствор хлорофоса из расчета 180 мг на 1 кг массы по ДВ. Через 15-30 мин, когда возникнет яркая картина отравления, ввести 0,1%-ньп раствор атропина сульфата под кожу в количестве 3 мл (или внутри венно 2 мл). Повторно атропин ввести через 45 мин. Протокол весп по схеме:

Наименование введенного препарата	Время наблюдения	Изменения в клиническом состоянии
		сост. ЦНС: возб., угнет.	сост. зрачка	саливация	дефекация	тремор
Хлорофос	Исходи, сост. Через 15 мин. Через 30 мин.
Атропина сульфат	Через 15 мин. Через 30 мин.

Задание по фармакотерапии

Выписать в рецептах и объяснить действие препаратов 1.10 овцам - 1,5%-ный раствор атропина сульфата.

2. Корове - комплексный антидот, состоящий из 1,5%-ного рас­твора атропина сульфата, 10%-ный раствор тропацина и 20%-ный рас­твор дипироксима.

3. 10 телятам - лекарственную смесь, состоящую из 0,9%-ного раствора натрия хлорида, 10%-ного раствора кальция хлорида, калия хлорида, тиамина бромида и аскорбиновой кислоты.

4. Лошади средство при сердечной слабости.

5. Витамины Bt и С для устранения параличей и слабости ске­летной мускулатуры.

6. Рассчитать потребность в атропине сульфате для 50 лошадей при отравлении фосфорорганическими соединениями.

Вопросы программированного контроля по токсикологии фосфорорганических соединений

I. Применение фосфорорганических соединений в сельском хозяй­стве.

1. Гербициды. 2^ Инсектициды. 3< Акарициды. 4. Нематоциды. 5. Фунгициды. 6. Бактерициды. 7.3ооциды. 8.Дефолианты.

П. Фосфорорганические инсектициды контактного действия.

1. Байтекс. 2. Антио. 3. Бромофос. 4. Амифос. 5. ДДВФ. 6. Метил-меркаптофос. 7. Тиофос. 8. Октаметил. 9. Трихлорметафос-3. 10. Пре­парат М-81. 11. Фталофос. 12. Фосфамид. 13- Хлорофос.

III. Фосфорорганические инсектициды системного действия

1. Байтекс. 2. Антио. 3. Бромофос. 4. Амифос. 5. ДДВФ. 6. Метил-меркаптофос. 7. Тиофос. 8. Октаметил. 9. Трихлорметафос-3. 10. Пре­парат М-81. 11.Фталофос. 12. Фосфамид. 13. Хлорофос.

IV. Фосфорорганические инсектициды, применяемые для защиты животных от кровососущих насекомых.

1. Контактного действия. 2. Системного действия.

V. Срок выжидания после обработки растений фосфорорганиче­скими инсектицидами контактного действия.

1. Не ранее 6 дней. 2. Не ранее 6 недель.

VI. Срок выжидания после обработки растений фосфорорганич­ескими инсектицидами системного действия

1. Не ранее 6 дней. 2. Не ранее 6 недель.

VII, Основные свойства фосфорорганических инсектицидов.

1. Высокая токсичность для насекомых и клещей. 2. Низкая ток­сичность для насекомых и клещей. 3. Высокая токсичность для чело­века и животных. 4. Низкая токсичность для человека и животных. 5. Узкий спектр действия. 6. Широкий спектр действия. 7. Являются липоидотропными веществами. 8. Хорошо всасываются через слизи­стые оболочки и кожу. 9. Обладают кумулятивным действием. 10. Ку­муляция отсутствует. 11. Большой расход на единицу обрабатываемой площади. 12. Малый расход на единицу обрабатываемой площади.

УШ. Что следует понимать под термином "летальный синтез"?

1. Превращение пестицида в организме в менее токсическое со­единение. 2. Превращение пестицида в организме в более токсическое соединение.

IX. Основные механизмы токсического действия фосфороргани­ческих соединений.

1. Образование в организме карбоксигемоглобина, 2. Образование метгемоглобина. 3. Угнетение активности холинэстеразы. 4. Угнетение активности Na+, K+, АТФ-азы.

X. Основные симптомы острого отравления фосфороганически-ми соединениями.

1. Бронхоспазм. 2. Расширение бронхов. 3. Судороги. 4. Мышеч­ные подергивания. 5. Сухость во рту. 6. Обильная саливация. 7. Уси­ление перистальтики кишечника. 8. Атония кишечника. 9. Частое мо­чеиспускание. 10. Анурия. 11. Миоз. 12. Мидриаз.

XI. Диагностическое значение определения активности холин­эстеразы при отравлении фосфорорганическими соединениями.

\. Основное. 2. Ориентировочное.

ХП. Метод изоляции фосфорорганических соединений из биоло­гического материала при химико-токсикологических исследованиях.

1. Подкисленной водой. 2. Перегонкой с водяным паром. 3. Ор­ганическими растворителями. 4. Минерализация.

XIII. Укажите препараты, которые следует применять при от­равлении фосфорорганическими соединениями.

\. Карбахолин. 2. Атропин. 3, Пилокарпин. 4. Тропацин. 5. Реак-тиваторы холинэстеразы. 6. Унитиол.

XIV. Фосфорорганические пестициды, присутствие которых не­допустимо в кормах для сельскохозяйственных животных.

1. Карбофос. 2. Хлорофос. 3. Фосфамид. 4. Трихлорметафос-3. 5. Метилмеркаптофос. 6. Тиофос. 7. Меркаптофос. 8. Октаметил.

XV. Указать Фосфорорганические пестициды максимально допу­стимый уровень которых в кормах для животных составляет не более 2 мг на 1 кг корма.

1. Карбофос. 2. Хлорофос. 3. Фосфамид. 4. Трихлорметафос-3. 5. Метилмеркаптофос. 6. Тиофос.