3.1.2.2. Цикл ди- и трикарбоновых кислот

У растений и других аэробных организмов пировиноградная кислота подвергается окислению до СО₂ и Н₂О в ходе реакций, промежуточными продуктами которых являются ди- и трикарбоновые кислоты. Поскольку указанные реакции впервые были изучены Г.А. Кребсом (1937) и осуществляются в виде циклических превращений они получили название цикла Кребса или цикла ди- и трикарбоновых кислот. Ферменты, катализирующие реакции цикла Кребса, локализованы в матриксе или во внутренней мембране митохондрий.

Непосредственно в реакции цикла Кребса вступает производное пировиноградной кислоты – ацетил-КоА, которое образуется в результате окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты, катализируемого мультиферментным пируватдегидрогеназным комплексом. Фер-ментный комплекс растворён в матриксе митохондрий и состоит из трёх ферментов: декарбоксилазы с тиаминпирофосфатом в качестве кофермента; дигидролипоилдегидрогеназы, содержащей ФАД; дигидролипоилтрансацетилазы, представляющей собой сердцевинный фрагмент в мультиферментном комплексе, включающий остатки липоевой кислоты. Продуктами окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты являются ацетил-КоА, восстановленные динуклеотиды НАД  Н и СО₂:

СН₃

|

С=О + HS–KoA + НАД⁺  CH₃–C~S–KoA + НАД  Н⁺ + Н⁺ + СО₂

| ||

СООН О

пировиноград- ацетил-КоА

ная кислота

НАД  Н включается в различные восстановительные реакции, катализируемые дегидрогеназами, или, как мы увидим далее, становится донором электронов и протонов для системы окислительного фосфорилирования, локализованной в мембранах митохондрий. Ацетил-КоА, как и пировиноградная кислота – важный промежуточный продукт обмена веществ организмов. Он используется для синтеза жирных кислот, углеводов и многих аминокислот и также образуется при их распаде.

В

СН–СООН СН₂–СООН (1)

|| + СН₃–СS–КоА + Н₂О  |

С(ОН)–СООН || С(ОН)–СООН + НS–КоА

О |

енольная форма СН₂–СООН

щавелевоуксусной ацетил-КоА лимонная

кислоты кислота

реакциях аэробного дыхания образовавшийся при окислительном декарбоксилировании пировиноградной кислоты ацетил-КоА включается в реакции цикла Кребса. Вначале происходит конденсация ацетил-КоА с енольной формой щавелевоуксусной кислоты, в ходе которой ацетильная группировка кофермента А соединяется с углеродной цепью щавелевоуксусной кислоты, в результате чего синтезируется лимонная кислота. Эту реакцию катализирует фермент цитратсинтаза (4.1.3.7):

СН–СООН СН₂–СООН (1)

|| + СН₃–С~S–КоА + Н₂О ¾® |

С(ОН)–СООН || С(ОН)–СООН + НS–КоА

О |

енольная форма СН₂–СООН

щавелевоуксусной ацетил-КоА лимонная

кислоты кислота

Фермент цитратсинтазу аллостерически ингибирует повышенная кон-

центрация АТФ. Поэтому при высокой обеспеченности клетки энергией,

когда повышается концентрация АТФ, вследствие ингибирования цитратсинтазы в реакции цикла Кребса будет меньше включаться ацетил-КоА и больше использоваться на биосинтетические процессы.

В

СН₂–СООН СН₂–СООН (2)

| |

С(ОН)–СООН  С–СООН + Н₂О

| ||

СН₂–СООН СН–СООН

лимонная кислота цис-аконитовая

кислота

ходе дальнейших превращений лимонная кислота превращается в цис-аконитовую кислоту в результате отщепления молекулы воды под действием фермента аконитатгидратазы (4.2.1.3), локализованного во внутренней мембране митохондрий:

В последующей реакции цис-аконитовая кислота под действием того же фермента присоединяет молекулу воды, превращаясь в изолимонную кислоту:

СН₂–СООН СН₂–СООН (3)

| |

С–СООН + Н₂О  СН–СООН

|| |

СН–СООН СН(ОН)–СООН

цис-аконитовая изолимонная

кислота кислота

Изолимонная кислота окисляется в щавелевоянтарную кислоту под действием НАД- или НАДФ-специфичного фермента изоцитратдегидрогеназы (1.1.1.41). Образовавшаяся щавелевоянтарная кислота самопроизвольно декарбоксилируется, превращаясь в -кетоглутаровую кислоту:

СН₂–СООН СН₂–СООН СН₂–СООН (4)

| НАД(Ф)⁺ | |

СН–СООН  СН–СООН  СН₂ + СО₂ + НАД(Ф)  Н + Н⁺

| | |

СН(ОН)–СООН СО–СООН СО–СООН

изолимонная щавелевоянтарная -кетоглутаровая

кислота кислота кислота

Фермент изоцитратдегидрогеназа ингибируется высокой концентрацией НАД  Н и аллостерически активируется лимонной кислотой. Это – опережающая активация, когда определённый метаболит (в данном случае лимонная кислота) активирует ферменты, катализирующие его последующие превращения.

П

СН₂–СООН СН₂–СООН (5)

| |

СН₂ + НS–КоА + НАД⁺  СН₂–СS–КоА + СО₂+ НАД  Н + Н⁺

| ||

СО–СООН О

-кетоглутаровая сукцинил-КоА

кислота

родукт реакции (4) -кетоглутаровая кислота, подобно пировиноградной кислоте, подвергается окислительному декарбоксилированию под действием -кетоглутаратдегидрогеназного ферментного комплекса, который имеет такой же состав и строение, как и пируватдегидрогеназный комплекс. В результате декарбоксилирования -кетоглутаровой кислоты образуется ацильная группировка янтарной кислоты, которая переносится на кофермент А с образованием макроэргического соединения сукцинилS–КоА. Суммарное уравнение процесса окислительного декарбоксилирования -кетоглутаровой кислоты можно представить в следующем виде:

В

ходе дальнейших превращений энергия макроэргической связи сукцинилS–КоА используется для синтеза АТФ, который осуществляется в процессе субстратного фосфорилирования и катализируется ферментом сукцинил-КоА-синтетазой (6.2.1.5). Вначале фермент образует макроэргическое промежуточное соединение с группировкой кофермента А, а ациль-ный радикал янтарной кислоты превращается в свободную янтарную кислоту. Затем группировка кофермента А в каталитическом центре фермента замещается на остаток фосфата с образованием макроэргического фосфофермента (ферментⓅ), от которого остаток фосфорной кислоты с макроэргической связью переходит на АДФ, осуществляя таким образом синтез АТФ. Суммарное уравнение процесса фосфоролитического расщепления сукцинил– КоА и сопряжённого с ним синтеза АТФ можно записать в виде следующей схемы:

СН₂СООН СН₂СООН (6)

| + Н₃РО₄ + АДФ  | + НSКоА + АТФ

СН₂СSКоА СН₂СООН

||

О янтарная кислота

сукцинил-КоА

К

СН₂СООН HOOC H (7)

| \ /

CH₂COOH + ФАД  C = C + ФАД  Н₂

/ \

H COOH

янтарная кислота фумаровая кислота

ак показано в представленных реакциях, у растений в результате фосфоролитического расщепления сукцинил-КоА осуществляется синтез АТФ, тогда как в клетках животного организма в аналогичном процессе происходит синтез ГТФ с участием ГДФ. Образовавшаяся в реакции (6) янтарная кислота окисляется с участием фермента сукцинатдегидрогеназы, локализованного во внутренней мембране митахондрий. В ходе этой реакции янтарная кислота превращается в фумаровую:

В

НООС Н (8)

\ / СН₂–СООН

С = С + Н₂О  |

/ \ СН(ОН)–СООН

Н СООН

фумаровая кислота яблочная кислота

следующей реакции к фумаровой кислоте присоединяется молекула воды под действием фермента фумаратгидратазы (4.2.1.2) и образуется яблочная кислота:

В дальнейшем яблочная кислота окисляется в щавелевоуксусную кислоту с участием НАД-специфичного фермента малатдегидрогеназы (1.1.1.37):

СН₂СООН СН₂СООН (9)

| + НАД⁺  | + НАД  Н + Н⁺

СН(ОН)СООН СОСООН

яблочная кислота щавелевоуксусная

кислота

К

СН₂СООН СНСООН (10)

|  ||

СОСООН С(ОН)СООН

кетоформа енольная форма

щавелевоуксусной щавелевоуксусной

кислоты кислоты

етоформа щавелевоуксусной кислоты самопроизвольно превращается в свою енольную форму:

После этого енольная форма щавелевоуксусной кислоты может взаи-

имодействовать с новой молекулой ацетилкофермента А, и рассмотренный

нами цикл реакций будет повторяться снова.

Если исключить промежуточные продукты, образующиеся в реакциях окислительного дикарбоксилирования пировиноградной кислоты и цикла Кребса, и записать только вещества, входящие в этот цикл и выходящие из него при условии полного прохождения всех указанных выше реакций, то можно получить следующее суммарное уравнение:

СН₃ССООН + 2Н₂О + 3НАД⁺ + НАД(Ф)⁺ + ФАД + Н₃РО₄ + АДФ 

||

О

 3СО₂ + 3НАД  Н + НАД(Ф)  Н + ФАД  Н₂ + 4Н⁺ + АТФ

Из этого уравнения следует, что пировиноградная кислота в ходе происходящих превращений окисляется с образованием трёх молекул СО₂ и пяти молекул восстановленных динуклеотидов НАД  Н, НАДФ  Н и ФАД  Н₂. Источником кислорода для реакций окисления служат молекулы воды, две из них показаны в левой части уравнения и одна высвобождается при взаимодействии Н₃РО₄ и АДФ. Молекулы воды также являются донорами электронов и протонов для синтеза восстановленных динуклеотидов.

Как видим, молекулы кислорода не принимают прямого участия в реакциях цикла Кребса, хотя указанные реакции и активируются кислородом. Непосредственное участие кислорода в реакциях дыхания происходит на стадии окисления восстановленных динуклеотидов, образующихся при окислительном декарбоксилировании пировиноградной кислоты и в реакциях цикла Кребса, с участием ферментных комплексов, локализованных во внутренних мембранах митохондрий. Эти процессы будут рассмотрены далее.

Кроме восстановленных динуклеотидов в цикле Кребса синтезируется также АТФ из неорганического фосфата и АДФ путём реализации механизма субстратного фосфорилирования при фосфоролизе сукцинил-КоА.

В реакциях окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты и цикла Кребса образуются не только важные биоэнергетические продукты, но и промежуточные метаболиты, с участием которых осуществляется связь обмена углеводов с обменом липидов, аминокислот, белков и других органических веществ в организме. Такими метаболитами являются ацетил-КоА и сукцинил-КоА, -кетоглутаровая, щавелевоуксусная, яблочная, лимонная, изолимонная, цис-аконитовая, фумаровая кислоты. Они могут включаться в синтез липидов, азотистых веществ, фенольных и терпеноидных соединений.

Поскольку в реальных физиологических условиях из цикла Кребса постоянно потребляются на различные биосинтетические процессы те или иные промежуточные метаболиты, циклический ход регенерации щавелевоуксусной кислоты полностью не завершается и для обеспечения хода реакций цикла постоянно поддерживается необходимая концентрация щавелевоуксусной кислоты в матриксе митахондрий путём её дополнительного синтеза.

У

СН₂ СН₂СООН

|| |

СОⓅ + СО₂ + Н₂О  СО + Н₃РО₄

| |

СООН СООН

фосфоенолпиро- щавелевоуксусная

виноградная кислота кислота

растений и бактерий первичный синтез щавелевоуксусной кислоты осуществляется под действием фермента фосфопируваткарбоксилазы из СО₂ и фосфоенолпировиноградной кислоты:

Таким образом, цикл Кребса является связующим звеном в обмене различных групп органических веществ и конечным этапом их окисления. В ходе этих реакций высвобождается значительное количество энергии окисляющихся субстратов и связывается главным образом в виде восстановленных форм динуклеотидов НАД  Н и ФАД  Н₂, энергия которых используется для синтеза АТФ.

3.1.2.3. Окисление биоэнергетических продуктов цикла Кребса

У аэробных организмов восстановленные формы динуклеотидов НАД  Н и ФАД  Н₂ подвергаются окислению молекулярным кислородом на заключительной стадии процесса дыхания. Их окисление катализируют ферментные комплексы, входящие в состав внутренней мембраны митохондрий, которую в настоящее время называют электронтранспортной цепью митохондрий (ЭТЦ). По современным представлениям она включает следующие компоненты:

2ē,2Н⁺ 2ē,2Н⁺

НАД  Н + Н⁺  ФМН 

ФАД  Н₂

 ‌

2ē,2Н⁺ ‌

↓ 2ē 2ē 2ē 2ē 2ē 2ē

 КоQ  цит. b  цит. с₁  цит. с  цит. а  цит. а₃ 1/2О₂  Н₂О

 ↑

 

2Н⁺

Как видно из приведенной схемы, электроны и протоны от ФАД  Н₂ и НАД  Н передаются на кофермент Q, который, превращаясь в восста-новленную форму, становится активным донором электронов для последовательности переносчиков, состоящей из цитохромов. Протоны высвобождаются в физиологическую среду и далее взаимодействуют с ионизированными атомами кислорода, образуя молекулы воды: 2Н⁺ + О^2-  Н₂О. Ионизация кислорода происходит в результате переноса на него электронов от цитохромной системы под действием фермента цитохромоксидазы, имеющего в своем составе цитохромы а и а₃.

Кофермент Q, или убихинон, как и пластохинон, относится к липидорастворимым производным хинона, содержащим в хиноидной группировке метоксильные группы и ненасыщенный изопреноидный радикал, включающий от шести до десяти изопреновых группировок. У млекопитающих и растений структура убихинона включает десять изопреновых группировок. Кофермент Q способен присоединять два электрона и два протона и превращаться в восстановленную форму:

О ОН

‖ |

С С

⁄ ╲ ∥ ╲

Н₃СО–С С–СН₃ СН₃ Н₃СО–С С–СН₃ СН₃

‖ ‖ | | ‖ |

Н₃СО–С С–(СН₂–СН=С–СН₂)₁₀Н Н₃СО–С С–(СН₂–СН=С–СН₂)₁₀Н

╲ ⁄ \\ ⁄

С С

‖ |

О ОН

окисленный восстановленный

убихинон убихинон

Окисленную форму убихинона принято записывать в виде символа КоQ или Q, восстановленную – КоQ  Н₂.

Большинство ферментов электронтранспортной цепи митохондрий связаны c их внутренней мембраной, плотность которой выше, чем у внеш-ней мембраны, и она содержит в своем составе больше белков и меньше фосфолипидов. В отличие от легкопроницаемой внешней мембраны внутренняя мембрана митохондрии непроницаема для многих соединений (за исключением нейтральных молекул с молекулярной массой менее 150).

Путём фрагментирования физическими и химическими методами внутренней мембраны метохондрий исследователям-биохимикам удалось выделить четыре ферментных комплекса, которые катализируют перенос электронов и протонов на определённых участках электронтранспортной цепи митохондрий. Перенос электронов и протонов между этими связанными с мембранами ферментными комплексами осуществляют подвижные переносчики – убихинон и цитохром c. Ферментные комплексы I, III и IV пронизывают внутреннюю митохондриальную мембрану и способны осуществлять перенос через мембрану протонов, создавая таким образом трансмембранный электрохимический потенциал.

Ферментный комплекс I осуществляет перенос электронов и протонов от НАД  Н, образующихся в цикле Кребса, на кофермент Q. Передача двух электронов и двух протонов происходит со стороны внутреннего матрикса митохондрии на флавинмононуклеотид (ФМН), входящий в состав ферментного комплекса I (рис. 3.4). Затем электроны передаются с участием FeS-белков от ФМН  Н₂ на димер убихинона 2Q, а протоны высвобождаются на внешней стороне митохондриальной мембраны.

Рис. 3.4. Схема переноса электронов и протонов по системе переносчиков, локализованных во внутренней мембране митохондрий

FeS_(1–3) – железосерные белки ферментного комплекса I; ФМН – акцептор электронов и протонов от НАД × Н в составе ферментного комплекса I; ФАД – акцептор электронов и протонов от янтарной кислоты в составе ферментного комплекса II; FeS – железосерные белки ферментного комплекса II; FeS_R – железосерный белок Риске в составе ферментного комплекса III; цит. в₅₅₆, цит. в₅₆₀, цит. c₁ – цитохромы в составе ферментного комплекса III; цит. а, цит. а₃ – цитохромы в составе ферментного комплекса IV; 2Q D 2Q × Н₂ – липидорастворимый переносчик электронов и протонов (убихинон); цит. c – водорастворимый переносчик электронов (цитохром с); АСК – АТФ-синтетазный комплекс.

Окисленный убихинон, приняв электроны от FeS-белка, присоединяет два протона из внутреннего матрикса и превращается в восстановленную форму 2Q  Н, которая диффундирует через липидную фазу митохондриальной мембраны к ферментному комплексу III. В составе ферментного комплекса III имеются цитохромы с₁, в₅₅₆ и в₅₆₀, а также железосерный белок Риске (FeS_R). Этот ферментный комплекс переносит электроны от восстановленного убихинона на цитохром с и одновременно выполняет функцию Н⁺-помпы, т.е. осуществляет трансмембранный перенос протонов.

При взаимодействии с ферментным комплексом III восстановленная форма убихинона 2Q  Н акцептирует два электрона от цитохрома в₅₆₀ и в таком состоянии становится способной присоединить два протона из внутреннего матрикса митохондрии, превращаясь в восстановленную форму 2Q  Н₂. Полностью восстановленный кофермент Q передает два электрона цитохрому в₅₅₆ и два электрона железосерному белку FeS_R, который далее передает их цитохрому с₁. Цитохром в₅₅₆, приняв два электрона от восстановленного кофермента Q, переводит далее в восстановленное состояние цитохром в₅₆₀, который снова может быть донором электронов для восстановления подвижного переносчика электронов и протонов – убихинона.

В процессе передачи электронов от восстановленного убихинона 2Q  Н₂ на цитохром с с участием ферментного комплекса III происходит высвобождение четырёх протонов с внешней стороны внутренней мембраны митохондрии, что приводит к созданию определённой величины транс-мембранного электрохимического потенциала. Таким образом, с участием цитохромов в₅₆₀ и в₅₅₆ оказывается возможным при переносе каждой пары экектронов и протонов от ферментного комплекса I на цитохром с присоединение из внутреннего матрикса и перенос через мембрану двух дополнительных протонов. После передачи электронов и протонов на ферментный комплекс III восстановленный убихинон превращается в окисленную форму и может снова диффундировать через липидную фазу митохондриальной мембраны к ферментному комплексу I (или II) и акцептировать новую пару электронов и протонов и далее осуществлять их перенос на ферментный комплекс III и т. д.

Ферментный комплекс II катализирует окисление янтарной кислоты с участием кофермента ФАД и передает электроны окисленному убихинону. Передачу электронов от ФАД  Н₂ на убихинон выполняют железо-серные группировки FeS_(1–3). Поскольку ферментный комплекс II не пересекает внутреннюю мембрану митохондрии, высвобождающиеся при окис-лении ФАД  Н₂ протоны остаются во внутреннем матриксе митохондрии и поэтому не используются для создания трансмембранного электрохимического потенциала. Однако при переносе каждой пары электронов от ФАД  Н₂ на цитохром с ферментный комплекс III осуществляет трансмембранный перенос двух протонов.

Функцию переноса электронов от ферментного комплекса III к ферментному комплексу IV выполняет водорастворимый белок цитрохром с, который способен перемещаться на внешней поверхности внутренней митохондриальной мембраны в жидкой физиологической среде, заполняющей пространство между внешней и внутренней мембранами митохондрии. Цитохром с акцептирует электроны от цитохрома с₁, находящегося в составе ферментного комплекса III, и перемещаясь в жидкой дисперсионной среде на внешней поверхности внутренней митохондриальной мембраны, передает их цитохрому а в составе ферментного комплекса IV, который кроме гемовой группировки содержит ещё атом меди, участвующий в переносе электронов. Восстановленный цитохром а передаёт электроны цитохрому a₃, в составе которого наряду с гемом активную роль в транспорте электронов выполняет атом меди. Восстановленный цитохром a₃, связывая кислород, ионизирует его атомы, отдавая им переносимые по цепи переносчиков электроны. Ионизированные атомы кислорода, взаимодействуя с протонами внутреннего митохондриального матрикса, образуют молекулы воды: О^2- + 2Н⁺  Н₂О.

Ферментный комплекс IV при переносе электронов от цитохрома с на кислород выполняет вместе с тем электрохимическую работу по переносу протонов из внутреннего митохондриального матрикса на внешнюю поверхность внутренней мембраны митохондрии.

В растительных клетках (в отличие от животных) с участием ферментов митохондрий происходит также окисление НАД  Н, поступающих из цитоплазмы. В этом процессе участвуют флавиновые дегидрогеназы, локализованные как во внешней, так и во внутренней мембране митохондрии. Первые из них передают электроны от НАД  Н, поступающих из цитоплазмы, на цитохром с, а вторые – окисленному убихинону. Восстановленные динуклеотиды НАДФ  Н не способны передавать электроны и про-тоны в электронтранспортную цепь митохондрий, а передают их на окисленные динуклеотиды НАД (НАД⁺) в результате так называемой трансгидрогеназной реакции.