3.1.1.2. Темновая стадия фотосинтеза

В ходе темновых реакций фотосинтеза происходит эндергонический процесс образования углеводов из диоксида углерода (СО₂) и воды, в котором в качестве энергетических источников используются продукты световых реакций НАДФ  Н и АТФ. Последовательность химических превращений в темновой стадии фотосинтеза была выяснена американскими биохимиками М. Кальвином, А. Бенсоном и Д. Басхемом в 1946–53 гг. и впоследствии названа циклом Кальвина, поскольку открытые ими превращения имели циклический механизм. Все эти реакции протекают в строме – жидкой дисперсионной среде хлоропластов.

В опытах с применением радиоактивных изотопов ¹⁴С и ³²Р было показано, что первичным акцептором, с которым в темновой стадии фотосинтеза взаимодействует СО₂, служит рибулозо-1,5-дифосфат. При этом было установлено, что при коротких экспозициях (0,1–5 сек.) фотоситезирующих клеток в суспензионной среде, содержащей ¹⁴СО₂, большая часть радиоактивной метки обнаруживается в карбоксильной группе 3-фос-фоглицериновой кислоты. Последнее свидетельствовало о том, что фосфоглицериновая кислота является первичным продуктом фотосинтеза.

У

СН₂ОⓅ СН₂ОⓅ СООН (1)

| | |

С=О НО–С–Н + Н–С–ОН

| + СО₂ + Н₂О  | |

Н–С–ОН СООН СН₂ОⓅ

|

Н–С–ОН 3-фосфоглицериновая кислота

| (2 молекулы)

СН₂ОⓅ

рибулозо-1,5-дифосфат

2 молекулы

3-фосфоглицериновой

рибулозо-1,5- енольная форма кислоты

дифосфат

казанную реакцию катализирует фермент рибулозодифосфаткарбоксилаза (4.1.1.39). Учитывая, что для образования карбоксильной группы кроме СО₂ требуется еще молекула воды, первую реакцию цикла Кальвина можно записать следующим образом:

Диоксид углерода в ходе реакции взаимодействует с енольной формой рибулозо-1,5-дифосфата – промежуточным соединением, образующимся из кетоформы, при этом возникает неустойчивый продукт – β–кетокислота, который под действием фермента гидролизуется, превращаясь в 3-фосфоглицериновую кислоту.

Фермент рибулозодифосфаткарбоксилаза в большом количестве содержится в хлоропластах растений (до 16% от общего количества белков), а также в клетках зелёных и пурпурных бактерий. Он состоит из восьми пар неидентичных субъединиц и имеет большую молекулярную массу (560 тыс.). Для проявления каталитической активности этого фермента необходимо присутствие катионов Mg²⁺.

Рибулозодифосфаткарбоксилаза аллостерически активируется фруктозо-6-фосфатом и аллостерически ингибируется фруктозо-1,6-дифосфа-том, которые образуются при последующих превращениях в цикле Кальвина 3-фосфоглицериновой кислоты, являющейся продуктом действия данного фермента. Образовавшаяся под действием рибулозодифосфаткарбоксилазы 3-фосфоглицериновая кислота в последующих реакциях восстанавливается до альдегида.

Вначале молекула 3-фосфоглицериновой кислоты активируется путём фосфорилирования с участием АТФ. Эту реакцию катализирует фермент фосфоглицераткиназа (2.7.2.3), активируемый катионами Мg²⁺:

СООН О

| фосфоглице- ‖ (2)

Н–С–ОН + АТФ  С–ОⓅ + АДФ

‌| раткиназа |

СН₂ОⓅ Н–С–ОН

|

СН₂ОⓅ

3-фосфоглицериновая 1,3-дифосфоглицериновая

кислота кислота

Продукт реакции 1,3-дифосфоглицериновая кислота – макроэргическое соединение, характеризующееся высоким потенциалом переноса фос-фатной группы, присоединённой к карбоксильной группировке (при гидролизе макроэргической фосфатной связи Gºˈ= –49 кДж  моль^-1), в связи с чем оно уже легко подвергается восстановлению в следующей реакции под действием фермента триозофосфатдегидрогеназы (1.2.1.9) с участием восстановленной формы динуклеотида НАДФ  Н:

О О (3)

‖ ‖

С–О~ Ⓟ триозофосфат- С–Н

| + НАДФ · Н + Н⁺  | + НАДФ⁺ + Н₃РО₄

Н–С–ОН дегидрогеназа Н–С–ОН

| |

СН₂ОⓅ СН₂ОⓅ

1,3-дифосфоглице- 3-фосфоглице-

риновая кислота риновый альдегид

В ходе восстановительной реакции происходит синтез 3-фосфогли-церинового альдегида и отщепление от 1,3-дифосфоглицериновой кислоты минерального фосфата. Участвующие в синтезе 3-фосфоглицеринового альдегида АТФ и НАДФ  Н являются продуктами световой стадии фотосинтеза.

Как было показано ранее, в результате связывания одной молекулы СО₂ в первой реакции цикла Кальвина образуются 2 молекулы 3-фосфо-глицериновой кислоты, которые в ходе реакций (2) и (3) превращаются в две молекулы 3-фосфоглицеринового альдегида, а последние довольно легко изомеризуются в фосфодиоксиацетон. Реакцию изомеризации катализирует фермент триозофосфатизомераза (5.3.1.1). Представленная реакция легко обратима, так как сопровождается небольшим изменением свободной энергии.

Н

| триозофосфат-

С=О изомераза СН₂ОН (4)

| → |

Н–С–ОН ← С=О

| |

СН₂ОⓅ СН₂ОⓅ

3-фосфоглице- фосфодиокси-

риновый альдегид ацетон

Образовавшиеся триозофосфаты не накапливаются в хлоропластах. Под действием фермента альдолазы (4.1.2.13) они конденсируются, превращаясь во фруктозо-1,6-дифосфат:

Н СН₂ОⓅ

‌| | (5)

СН₂ОН С=О С=О

| | альдолаза |

С=О + Н–С–ОН  НО–С–Н

| | |

СН₂ОⓅ СН₂ОⓅ Н–С–ОН

|

фосфодиокси- 3-фосфоглицери- Н–С–ОН

ацетон новый альдегид |

СН₂ОⓅ

фруктозо-1,6-дифосфат

После этого происходит гидролитическое отщепление от фруктозо-1,6-дифосфата остатка фосфорной кислоты. Реакцию катализирует фермент фруктозо-1,6-дифосфатаза (3.1.3.11). В ходе этой реакции фруктозодифосфат превращается во фруктозо-6-фосфат:

СН₂ОⓅ СН₂ОН (6)

| |

С=О фруктозо- С=О

| 1,6-дифос- |

НО–С–Н + Н₂О  НО–С–Н + Н₃РО₄

| фатаза |

Н–С–ОН Н–С–ОН

| |

Н–С–ОН Н–С–ОН

| |

СН₂ОⓅ СН₂ОⓅ

фруктозо-1,6-дифосфат фрутозо-6-фосфат

Фруктозо-1,6-дифосфатаза – активируемый светом фермент. Его активирование происходит с участием восстановленного под действием света ферредоксина, который совместно со специфическим белком переводит фруктозо-1,6-дифосфатазу в активное состояние. От действия этого фермента зависит интенсивность включения СО₂ в первой реакции цикла Кальвина. Если активность фруктозо-1,6-дифосфатазы низкая, то повышается концентрация фруктозо-1,6-дифосфата, который аллостерически ингибирует фермент рибулозодифосфаткарбоксилазу, вследствие чего понижается скорость первой реакции цикла Кальвина, катализируемой данным ферментом.

На следующем этапе темновой стадии фотосинтеза фермент транскетолаза (2.2.1.1) катализирует перенос концевого двууглеродного радикала, содержащего кетонную группу, от фруктозо-6-фосфата на 3-фосфо-глицериновый альдегид, который образуется в результате присоединения к рибулозо-1,5-дифосфату ещё одной молекулы СО₂ и повторения реакций (2) и (3). В результате взаимодействия гексозы и триозы синтезируются новые углеводные продукты – эритрозо-4-фосфат и ксилулозо-5-фосфат:

Н (7)

СН₂ОН Н |

| |‌ С=О СН₂ОН

С=О С=О | |

| | транскето- Н–С–ОН С=О

НО–С–Н + Н–С–ОН  | + |

| | лаза Н–С–ОН НО–С–Н

Н–С–ОН СН₂ОⓅ | |

| СН₂ОⓅ Н–С–ОН

Н–С–ОН 3-фосфоглицери- эритрозо-4- |

| новый альдегид фосфат СН₂ОⓅ

СН₂ОⓅ

фруктозо-6-фосфат ксилулозо-5-фосфат

Ещё одна молекула 3-фосфоглицеринового альдегида, синтезированная в результате связывания с первичным акцептором второй молекулы СО₂, изомеризуется далее в реакции (4) в фосфодиоксиацетон, который затем соединяется с эритрозо-4-фосфатом, образуя седогептулозо-1,7-дифос-фат. Эту реакцию катализирует фермент трансальдолаза (2.2.1.2):

Н СН₂ОⓅ (8)

| |

СН₂ОⓅ С=О С=О

| | трансальдо- |

С=О + Н–С–ОН  НО–С–Н

| | лаза |

СН₂ОН Н–С–ОН Н–С–ОН

| |

фосфодиоксиацетон СН₂ОⓅ Н–С–ОН

|

эритрозо-4-фосфат Н–С–ОН

|

СН₂ОⓅ

седогептулозо-1,7-дифосфат

В

СН₂ОⓅ СН₂ОН (9)

| |

С=О С=О

| фосфатаза |

НО–С–Н + Н₂О  НО–С–Н + Н₃РО₄

| |

Н–С–ОН Н–С–ОН

| |

Н–С–ОН Н–С–ОН

| |

Н–С–ОН Н–С–ОН

| |

СН₂ОⓅ СН₂ОⓅ

седогептулозо-1,7-дифосфат седогептулозо-7-фосфат

следующей реакции происходит гидролиз седогептулозо-1,7-ди-фосфата, который катализирует специфическая фосфатаза. В ходе реакции от седогептулозо-1,7-дифосфата отщепляется остаток фосфорной кислоты и таким образом осуществляется синтез седогептулозо-7-фосфата:

После этого снова вступает в действие фермент транскетолаза, катализирующий перенос двууглеродного радикала с кетогруппой от седогептулозо-7-фосфата на 3-фосфоглицериновый альдегид. Еще одна молекула 3-фосфоглицеринового альдегида синтезируется за счёт связывания в первой реакции цикла Кальвина уже третьей молекулы СО₂. Продукты реакции, катализируемой транскетолазой (10), – пятиуглеродные производные моносахаридов ксилулозо-5-фосфат и рибозо-5-фосфат.

В

СН₂ОН СН₂ОН (11)

| |

С=О риболозофосфат- С=О

| эпимераза |

НО–С–Н  Н–С–ОН

|  |

Н–С–ОН Н–С–ОН

| |

СН₂ОⓅ СН₂ОⓅ

ксилулозо-5-фосфат рибулозо-5-фосфат

последующих реакциях цикла Кальвина осуществляется изомеризация фосфорнокислых производных пентоз, которая обеспечивает регенерацию первичного акцептора СО₂ – рибулозо-1,5-дифосфата. Образовавшиеся в реакциях (7) и (10) молекулы ксилулозо-5-фосфата превращаются в рибулозо-5-фосфат под действием фермента рибулозофосфатэпимеразы (5.1.3.1), который способен изменять на противоположную пространственную ориентацию водорода и гидроксильной группы у третьего углеродного атома пентозы (реакция 11).

Н (10)

СН₂ОН Н | ‌

| | СН₂ОН С=О

С=О С=О | |

| | транскетолаза С=О Н–С–ОН

НО–С–Н + Н–С–ОН  | + |

| | НО–С–Н Н–С–ОН

Н–С–ОН СН₂ОⓅ | |

| Н–С–ОН Н–С–ОН

Н–С–ОН 3-фосфоглицери- | |

| новый альдегид СН₂ОⓅ СН₂ОⓅ

Н–С–ОН

| ксилулозо-5- рибозо-5-

СН₂ОⓅ фосфат фосфат

седогептулозо-7-фосфат

СН₂ОН СН₂ОН (11)

| |

С=О риболозофосфат- С=О

| эпимераза |

НО–С–Н ¾¾¾® Н–С–ОН

| ¬¾¾¾ |

Н–С–ОН Н–С–ОН

| |

СН₂ОⓅ СН₂ОⓅ

ксилулозо-5-фосфат рибулозо-5-фосфат

П

Н (12)

‌ |

С=О СН₂ОН

| рибозофосфат- |

Н–С–ОН изомераза С=О

|  |

Н–С–ОН  Н–С–ОН

| |

Н–С–ОН Н–С–ОН

| |

СН₂ОⓅ СН₂ОⓅ

рибозо-5-фосфат рибулозо-5-фосфат

ревращение рибозо-5-фосфата в рибулозо-5-фосфат катализирует фермент рибозофосфатизомераза (5.3.1.6):

СН₂ОН СН₂ОⓅ (13)

| |

С=О С=О

| фосфорибулокиназа |

Н–С–ОН + АТФ  Н–С–ОН + АДФ

| |

Н–С–ОН Н–С–ОН

| |

СН₂ОⓅ СН₂ОⓅ

рибулозо-5-фосфат рибулозо-1,5-дифосфат

Окончательную регенерацию первичного акцептора СО₂ осуществляет фермент фосфорибулокиназа (2.7.1.19), катализирующий фосфорилирование от АТФ рибулозо-5-фосфата (реакция 13).

В ходе указанных тринадцати реакций происходит включение в состав углеводных производных трёх молекул СО₂ и потребление трёх молекул первичного акцептора рибулозо-1,5-дифосфата, при этом осуществляется синтез шести молекул 3-фосфоглицеринового альдегида, из которых пять затрачиваются на регенерацию трёх молекул рибулозо-1,5-дифосфата и одна молекула 3-фосфоглицеринового альдегида остаётся как продукт темновой стадии фотосинтеза. Её синтез сопряжён с использованием биоэнергетических продуктов световой стадии фотосинтеза АТФ и НАДФ  Н.

Восстановленные динуклеотиды НАДФ  Н участвуют в реакции (3) цикла Кальвина, которая в ходе синтеза 6 молекул 3-фосфоглицеринового альдегида повторяется 6 раз и, следовательно, в этих реакциях используется 6 молекул восстановленных динуклеотидов НАДФ  Н. АТФ участвует в реакции (2), которая, как и реакция 3, повторяется 6 раз, и в реакции (13), которая при синтезе 3 молекул первичного акцептора СО₂ рибулозо-1,5-дифосфата повторяется 3 раза. Всего при связывании 3 молекул СО₂ и восстановлении их до уровня 3-фосфоглицеринового альдегида потребляется 9 молекул АТФ.

Однако 3-фосфоглицериновый альдегид не накапливается в хлоропластах, он используется для синтеза гексозы. Часть молекул 3-фосфогли-церинового альдегида изомеризуется в фосфодиоксиацетон, который далее под действием альдолазы конденсируется с оставшимися молекулами 3-фосфоглицеринового альдегида, и таким образом осуществляется синтез фруктозо-1,6-дифосфата. После гидролиза этого соединения с участием фермента фруктозо-1,6-дифосфатазы образуется фруктозо-6-фосфат. Если учесть, что для синтеза фруктозо-6-фосфата потребуется связывание 6 молекул СО₂ в первой реакции цикла Кальвина и все вышеуказанные превращения, связанные с синтезом одной молекулы 3-фосфоглицеринового альдегида, должны повториться еще раз, суммарное уравнение темновой стадии фотосинтеза может быть записано в следующем виде:

ферменты

6СО₂ + 11Н₂О + 18АТФ + 12НАДФ  Н + 12Н⁺ 

цикла Кальвина

 фруктозо-6-фосфат + 18АДФ + 12НАДФ⁺ + 17Н₃РО₄

Следует отметить, что из всех реакций цикла Кальвина только первая и последняя (13) специфичны для фотосинтезирующих клеток, тогда как другие реакции могут протекать в любых других клетках и тканях фотосинтезирующих организмов в ходе синтеза, распада и превращений углеводов. При этом промежуточные метаболиты, образующиеся в цикле Кальвина, выводятся из этого цикла и потребляются для синтеза различных органических веществ в хлоропластах и листьях растений. Конечный продукт цикла Кальвина фруктозо-6-фосфат также включается в биосинтетические реакции, происходящие в фотосинтезирующих тканях, или превращается в транспортные формы, которые по сосудам флоэмы поступают в акцепторные органы растений.