53. Люминесцентная микроскопия и ее использование для исследования объектов судебной экспертизы.

Люминесцентный метод микроскопии занимает важное место в исследовании микроорганизмов. Люминесценцией (или флюоресценцией) называют излучение клеткой света за счет поглощенной энергии. Только немногие бактерии (люминесцирующие) способны светиться собственным светом в результате интенсивных процессов окисления, протекающих у них со значительным выделением энергии.

Большинство микроорганизмов приобретает способность люминесцировать, или флюоресцировать, при освещении их ультрафиолетовыми лучами после предварительной окраски специальными красителями — флюорохромами. Поглощая короткие ультрафиолетовые волны, объект излучает более длинные волны видимой части спектра. Вследствие этого разрешающая способность микроскопа повышается. Это дает возможность исследовать более мелкие частицы. Чаще используют красители- флюорохромы: акридин оранжевый, аурамин, корифосфин, флюоресцеин в виде очень слабых водных растворов.

При окраске корифосфином коринебактерии дифтерии дают желто-зеленое свечение в ультрафиолетовом свете, микобактерии туберкулеза при окраске аурамин-родамином — золотисто-оранжевое. Для успешной микроскопии необходим яркий источник света, в качестве которого используют ртутно-кварцевую лампу высокого давления. Между источником света и зеркалом помещают сине-фиолетовый светофильтр, который пропускает только короткие и средние волны ультрафиолетового света. Попав на объектив, эти волны возбуждают в нем люминесценцию. Чтобы увидеть ее, на окуляр микроскопа надевают желтый фильтр, который пропускает длинноволновый свет флюоресценции, возникающий при прохождении лучей через объект. Короткие волны, не поглощенные исследуемым объектом, убираются, отсекаются этим фильтром.

Существуют специальные люминесцирующие микроскопы МЛ-1, МЛ-2, MЛ-3, а также простые устройства: комплект ОИ-17 (опакиллюминатор), ОИ-18 (осветительное устройство с ртутно-кварцевой лампой СВД-120А), дающие возможность применять для люминесцентной микроскопии обычный биологический микроскоп.

54. Электронная микроскопия, ее виды и использование ее для исследования объектов судебной экспертизы.

Электронная микроскопия позволяет с помощью электронного микроскопа исследовать микроструктуру тел при увеличениях до многих сотен тысяч раз (вплоть до атомно-молекулярного уровня), изучить их локальный состав и локализованные на поверхностях или в микрообъёмах тел электрические и магнитные поля (микрополя). Кроме этого, электронная микроскопия - это самостоятельное научное течение, направленное на:

-усовершенствование и разработку новых электронных микроскопов и других корпускулярных микроскопов (например, протонного микроскопа) и приставок к ним;

-разработку методик препарирования образцов, исследуемых в электронных микроскопах;

-изучение механизмов формирования электроннооптических изображений;

-разработку способов анализа разнообразной информации (не только изображений), получаемой с помощью электронных микроскопов.

Некоторые методы электронной микроскопии рассмотрены в разделе "Методика электронной микроскопии".

К сожалению, электронная микроскопия ограничена в своих возможностях по исследованию и диагностике поверхности. Несмотря на огромные плюсы, которые она имеет, существует несколько неоспоримых недостатков. К таковым следует отнести, в первую очередь, необходимость достаточного вакуума для получения относительно хорошего разрешения, отсутствие возможности просмотра больших образцов, достижение атомного разрешения в критических для поверхности условиях, когда энергия пучка электронов достигает величины до 300 КэВ.

В связи с этим мы предлагаем Вам ознакомиться с методами сканирующей туннельной микроскопии, сканирующей зондовой микроскопии, атомно-силовой микроскопии.

Методика электронной микроскопии. Область применения электронной микроскопии

В качестве объектов исследований электронная микроскопия использует в основном твёрдые тела. Образцы толщиной от 1 нм до 10 мкм (тонкие плёнки, фольга, срезы и т. п.) изучаются в просвечивающих электронных микроскопах (ПЭМ), в которых электроны с энергиями от 1 кэв до 5 Мэв проходят сквозь объект. Непросвечивающие электронные микроскопы: растровые (РЭМ), зеркальные, ионные и электронные проекторы исследуют структуру массивных тел толщиной существенно больше 1 мкм.

Можно изучать порошки, микрокристаллы, частицы аэрозолей и т. д., нанеся их на подложку: тонкую плёнку для исследования в ПЭМ или массивную подложку для исследования в РЭМ.

В дальнейших разжелах описаны некоторые методы электронной микроскопии.

С помощью специальных газовых микрокамер — приставок к просвечивающему или растровому электронному микроскопу — можно изучать жидкие и газообразные объекты, неустойчивые к воздействию высокого вакуума, в том числе влажные биологические препараты. Радиационное воздействие облучающего электронного пучка довольно велико, поэтому при исследовании биологических, полупроводниковых, полимерных и т. п. объектов необходимо тщательно выбирать режим работы электронного микроскопа, обеспечивающий минимальную дозу облучения.

Кроме статических объектов электронная микроскопия позволяет изучать различные процессы в динамике их развития: рост плёнок, деформацию кристаллов под действием переменной нагрузки, изменение структуры под влиянием электронного или ионного облучения и т. д. . Электрон имеет малую инерционность. Это дает возможность исследовать периодические во времени процессы, такие как перемагничивание тонких магнитных плёнок, переполяризацию сегнетоэлектриков, распространение ультразвуковых волн и т. д., применяя методы стробоскопической электронной микроскопии. Электронный пучок «освещает» образец импульсами, синхронными с подачей импульсного напряжения на образец, благодаря чему на экране прибора фиксируется определенная фаза процесса. Предельное временное разрешение при этом может составлять около 10-15 сек для просвечивающего электронного микроскопа (практически реализовано разрешение ~ 10-10 сек для просвечивающего и растрового электронного микроскопа).

Электронные микроскопы используются и в технологических целях (например, для изготовления микросхем методом фотолитографии).

К сожалению, электронная микроскопия ограничена в своих возможностях по исследованию и диагностике поверхности. Несмотря на огромные плюсы, которые она имеет, существует несколько неоспоримых недостатков. К таковым следует отнести, в первую очередь, необходимость достаточного вакуума для получения относительно хорошего разрешения, отсутствие возможности просмотра больших образцов, достижение атомного разрешения в критических для поверхности условиях, когда энергия пучка электронов достигает величины до 300 КэВ.