Глава 4 / роль наследственности, конституции и возраста в патологии

131

Подходы к ДНК-диагностике наследственных болезней

Таблица 19

Прямая

диагностика

мутаций

• Детекция крупных перестроек (мутаций) генов методами блот-гибридизации с исполь­ зованием ДНК-зондов;

• выявление крупных и мелких делеций генов ПЦР-амплификацией отдельных фрагмен­ тов, в том числе мультиплексной ПЦР;

• детекция внутригенных мутаций, изменяющих сайты узнавания определенных рестрик- таз (и вследствие этого - размер фрагментов, выявляемых блот-гибридизацией или ПЦР-амплификацией);

• аллель-специфическая гибридизация (амплификация) с использованием олигонуклео- тидов, комплементарных нормальной или мутантнои последовательности ДНК;

• детекция конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК (single strand conformation polymorphism);

• метод детекции ошибок спаривания (cleavage mismatch detection);

• гетеродуплексный анализ фрагментов гена;

• секвенирование гена или его фрагмента

Косвенная (непрямая) молекулярная диагностика

Анализ косегрегации генетических маркеров (микро- и минисателлиты, ПДРФ), сцеплен­ных с патологическим геном, и болезни в семьях

ваний. Все разнообразие подходов для иденти­фикации генов или определенных фрагментов ДНК и их вариаций основывается на двух ос­новных методических разработках - технологии блот-гибридизации и амплификации отдельных участков ДНК.

Геномная ДНК

Общая схема блот-гибридизации по Саузерну представлена на рис. 33 (метод назван по имени

Электрофорез

Перенос на нитроцеллюлозу

Гибридизация

Меченый ДНК-зонд

Образец крови

	■>.-,;
		ш

Авторадиография

Детекция флуоресцентной

метки Рис. 33. Блот-гибридизация по Саузерну

доктора из Эдинбурга Эдмунда Саузерна, а анг­лийское blot означает промокать).

В основу методики амплификации положена полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая позволяет в течение нескольких часов выделить и размножить определенный фрагмент ДНК в количестве, превышающем исходное в 10⁹ раз. Такая высокая степень направленного обогаще­ния значительно упрощает работу с минималь­ными количествами ДНК-образцов. Реакция высоко специфична и чувствительна, позволяет исследовать единичную копию гена в исходном материале.

В табл.19 приводятся другие методы геноти-пирования, основанные главным образом на этих же двух технологиях, а также обозначены под­ходы к ДНК-диагностике болезней (прямая и косвенная диагностика).

Методы моделирования. Как и в других раз­делах биологии и медицины, в генетике челове­ка и медицинской генетике широко применяют­ся методы моделирования. Они разделяются на две группы: биологические и математические.

Для изучения многих моногенных болезней человека используются животные, несущие му­тации в гомологичных генах. Они являются удоб­ными моделями для исследования молекуляр­ных основ патогенеза и отработки оптимальных вариантов лечения. С этой целью во многих пи­томниках мира созданы и поддерживаются кол­лекции генетических линий животных (мышей, крыс, кроликов, собак и др.). Мировая коллек­ция мышей насчитывает несколько сотен линий с моногенно наследуемыми дефектами.

132