6.Чим відрізняються між собою такі показники як концентрація бактерій

ібіомаса?

7.Які існують методи визначення концентрації бактерій?

8.Які методи визначення біомаси Ви знаєте?

9.Що таке періодична культура?

10.Охарактеризуйте фази росту періодичної культури?

11.Чим зумовлене настання стаціонарної фази росту?

Лабораторна робота № 9

РІСТ МІКРООРГАНІЗМІВ У ПЕРІОДИЧНІЙ КУЛЬТУРІ. ВПЛИВ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ НА ПОКАЗНИКИ РОСТУ МІКРООРГАНІЗМІВ

(закінчення) (4 год.)

Мета роботи: оцінка впливу умов культивування (концентрація джерел вуглецю, азоту, фосфору, концентрація інокуляту тощо) на показники мікроорганізмів у періодичній культурі, побудова кривої росту мікроорганізмів і визначення параметрів кривої росту.

Матеріали та обладнання: спиртівки, бактеріологічні петлі, предметні і накривні скельця, чашки Петрі з агаризованим середовищем(ГКА або СА), мікроскопи, досліджувані культури мікроорганізмів, фотоелектроколориметр, кювети (5 мм).

Загальні відомості

Параметри кривої росту. Основними параметрами кривої росту(рис. 9.1) є біомаса, швидкість росту та тривалість лаг-фази(у разі, якщо ріст періодичної культури аналізують за збільшенням біомаси, не за кількістю клітин).

Біомаса – це різниця між максимальною та вихідною біомасою бактерій:

Цю величину виражають у грамах сухої речовини. Важливим показником є відношення врожаю клітин до кількості спожитого субстрату– Х/S. Якщо ці

м о л я р н и м е к о н о м і ч н и м к о е ф і ц і є н т о м.

Швидкість експоненційного росту – це міра швидкості росту клітин в експоненційній фазі. Її визначають за формулою виходячи з початкової та кінцевої біомаси Х0 та Хt у моменти часу t0 та t:

75

Рис. 9.1. Параметри кривої росту:

А – урожай клітин (біомаса); Б – швидкість росту; В – тривалість лаг-фази

Тривалість лаг-фази (Тl) – визначають як проміжок часу між моментом tr, в який культура досягла певної біомаси Хr, і моментом tі, в який вона могла б

досягти такої самої біомаси, якби відразу ж після інокуляції починався експоненційний ріст.

Ріст у безперервній культурі. Метод безперервного культивування полягає в тому, що в посудину (ферментатор, культиватор), в якій вирощуються бактерії, весь час надходить свіже поживне середовище і одночасно з такою самою швидкістю відводиться культуральна рідина, яка вміщує бактеріальні

76

перебувають у фазі експоненційного росту за постійної концентрації субстрату та інших незмінних умов. Розглянемо безперервне культивування в режимі хемостату та турбідостату.

Ріст у хемостаті. У цьому режимі ріст бактерій контролюється концентрацією субстрату. Підтримуючи постійну концентрацію одного з необхідних субстратів (джерело азоту чи вуглецю) регулюванням швидкості протоку середовища (швидкості надходження поживного середовища), можна

де f – швидкість протоку (швидкість надходження поживного середовища в л за 1 год), V – об’єм культиватора, л.

Отже, величина D відображує об’єм рідини, який змінюється за 1 годину. Швидкість зміни біомаси в культиваторі dХ/dt визначається за рівнянням

однаковими, то втрати в результаті вимивання клітин і приріст біомаси врівноважують одне одного, тобто зміна дорівнює нулю і біомасаХ залишається постійною. Культура при цьому перебуває в стані динамічної рівноваги.

Ріст культури в хемостаті контролюється концентрацією субстрату. На

регулюванні швидкості протоку середовища густиною(мутністю) популяції. Датчик мутності регулює через керуючу систему надходження поживного середовища. Турбідостатний контроль може грунтуватися на інших методах вимірювання біомаси або продуктів, які утворюються в процесі їхнього росту. Наприклад, рН–статний спосіб керування швидкістю протоку, використання оксистату – управління швидкістю протоку за швидкостю споживання кисню.

Принципові відмінності між періодичною та безперервн культурами:

Періодичну культуру можна розглядати як замкнуту систему(якоюсь мірою подібну до багатоклітинного організму), яка в своєму розвитку проходить кілька фаз (лаг-фаза, експоненційна та ін.). Умови існування у всіх цих фазах різні. Автоматичне регулювання в періодичній культурі навряд чи можливе.

Безперервна культура – це відкрита система, яка намагається досягти динамічної рівноваги. Фактор часу певною мірою виключається. Для організмів створюються незмінні умови середовища. Легко піддається автоматичному регулюванню.

77

Завдання на виконання

1.Аналіз посівів перевірки стерильності поживних середовищ

(лабораторна робота № 8).

2.Мікробіологічний контроль посівів(лабораторна робота №8).

Здійснюється шляхом мікроскопії(препарати «роздавлена крапля»), а також розсівом на чашки Петрі з агаризованим середовищем(ГКА, або СА) до ізольованих колоній.

3.Аналіз посівів з дослідження впливу умов культивування на

показники росту мікроорганізмів у періодичній культурі(лабораторна робота № 8). Ріст мікроорганізмів оцінюють за оптичною густиною клітинної суспензії (ФЕК, 540 нм, довжина світлового шляху5 мм). За одержаними даними побудувати графік – криву росту (калібрувальні графіки перерахунку оптичної густини клітинної суспензії на біомасунаведено на рис. 9.2. і 9.3). Визначити тривалість лаг-фази, питому швидкість росту в експоненційній фазі росту, рівень біомаси, вихід біомаси від заданого субстрату. Одержані дані оформити у вигляді табл. 9.1. Узагальнити результати дослідів, одержаних іншими студентами за іншими варіантами. Скласти загальну таблицю. Зробити загальні висновки.

Контрольні запитання

1.Охарактеризуйте параметри кривої росту.

2.Як визначається рівень біомаси?

3.Як можна розрахувати економічний коефіцієнт?

4.Як визначається тривалість лаг-фази?

мікроорганізмів?

78

8.Охарактеризуйте культивування у режимі хемостату.

9.Охарактеризуйте культивування у режимі турбідостату.

10.Назвіть принципові відмінності між періодичною табезперервною культурами.

79

Лабораторна робота № 10

МІКРОБІОЛОГІЧНИЙ КОНТРОЛЬ СИРОВИНИ, ВИКОРИСТОВУВАНОЇ У БІОТЕХНОЛОГІЧНІЙ І ХАРЧОВІЙ ПРОМИСЛОВОСТІ, А ТАКОЖ БІОТЕХНОЛОГІЧНОЇ І ХАРЧОВОЇ ПРОДУКЦІЇ (4 год)

групи кишкової палички (показник БГКП), а також грибів і дріжджів у різних видах води, сировини, біотехнологічної та харчової продукції.

80

Матеріали та обладнання: спиртівки, колби і пробірки з стерильною водопровідною водою, стерильні піпетки, шпателі Дригальського, чашки Петрі з МПА, з середовищем ЕНДО, Чистовича (або середовищем №10) і суслоагаром, рідке капустяне середовище (капустяна вода), зразки біотехнологічної та харчової продукції(сухі та пресовані хлібопекарські дріжджі, кефір або сметана, пиво або вино тощо), зразки сировини (меляса, борошно, солод тощо), зразки води (річкова, водопровідна, артезіанська, колодязна, акваріумна), термостат.

Загальні відомості

Однією з умов одержання доброякісної харчової та біотехнологічної продукції є дотримання санітарно-гігієнічних вимог у процесі виробництва. З метою виявлення та попередження контамінації сторонньою мікрофлорою на всіх підприємствах харчової та біотехнологічної галузі проводиться строгий мікробіологічний контроль сировини та готової продукції.

На харчових підприємствах можуть бути як зовнішні, так і внутрішні джерела контамінації. До зовнішніх належать сировина, вода і повітря. До

Сторонні мікроорганізми, потрапивши у виробничий процес, за сприятливих умов швидко розмножуються, і якщо не застосувати відповідні заходи для їх знищення, розповсюджуються по всьому підприємству. У результаті життєдіяльності мікроорганізмів порушується технологічний процес, зростають втрати сировини, знижується вихід та якість готової продукції.

Мікроорганізми, які потрапляють у виробництво, можуть бути як нешкідливими для здоров’я людини, так і призводити до тяжких інфекційних захворювань та харчових отруєнь. Тому важливим є визначення санітарнопоказових мікроорганізмів, у першу чергу, в сировині та готовій продукції.

Мікрофлора харчових продуктів являє собою складну динамічну систему,

см3) продукту. Основним кількісним тестом є кількість живих мезофільних аеробних і факультативно-анаеробних мікроорганізмів у1 г (1 см3) продукту – число МАФАМ. Для більшості продуктів цей показник нормується. Чим вище число МАФАМ, тим більша імовірність потрапляння в досліджуваний об’єкт патогенних мікроорганізмів – збудників інфекційних захворювань та харчових отруєнь.

Стійкість харчових продуктів під час зберігання оцінюють також за кількістю міцеліальних грибів, дріжджів і специфічних для кожного виду продукції збудників псування.

81

Зметою прогнозування можливих видів псування продукту чи сировини,

атакож їх безпечності для здоров’я населення, використовують якісні мікробіологічні показники.

Якісні показники вказують на відсутність(наявність) мікроорганізмів конкретних видів у певній масі продукту чи сировини.

Пряме виявлення у харчових продуктах патогенних або - умовно

промисловості використовують різні види сировини: мелясу, кукурудзяний екстракт, солод, борошно, цукор тощо.

82

У м ел яс і визначають загальну кількість мікроорганізмів в1 г, якісний

83

дріжджі. Контроль здійснюють мікроскопуванням або висівом на поживні середовища, використовувані для аналізу меляси. Допускається зараження від 5·102 до 104 КУО/г. Під час переробки сильно обнасіненого кукурудзяного

екстракту необхідну порцію перед використанням розбавляють водою у співвідношенні 1:1 та парою доводять температуру до 90−95 °С.

С ол о д одержують замочуванням і пророщуванням зерна, при цьому його численна мікрофлора активізується і посилено розмножується. Загальна кількість мікроорганізмів у солоді збільшується 10у−20 разів порівняно з мікрофлорою зерна. Склад мікроорганізмів солоду безпосередньо залежить від якості зерна, умов його зберігання та підготовки до солодорощення(якості промивання і дезинфекції).

На зібраному доброякісному зерні переважає бактеріальна мікрофлора, що не утворює спор– гнильні бактерії родуPseudomonas, гомо- і гетероферментативні молочнокислі бактерії. Вони становлять до90 % всіх мікроорганізмів, які знаходяться на поверхні зерна. Показником доброякісності зерна є високий вміст клітин Ervinia herbicola (трав’яна паличка), які належать до сапрофітної мікрофлори. Міцеліальна мікрофлора свіжезібраного зерна

спороутворювальних бактерій спостерігається за підвищеної вологості зерна. Так, у ячмені, сильно ураженому міцеліальними грибами, виявляються токсичні речовини: афлатоксини, охратоксини та .інЯчмінь з різко вираженими ознаками псування має низьку пророслість і непридатний для виготовлення солоду.

Серед мікроорганізмів свіжопророслого солоду переважають гриби родів

Penicillium, Aspergillus, Rhizopus, Mucor, Endomyces. Для попередження мікробної контамінації солоду проводять дезінфекцію обладнання, приміщень антисептиками: хлорним вапном, формаліном, 2−4 %-им розчином мідного купоросу. Зерно, яке надходить на замочування, після ретельного миття теж дезінфікують розчинами перманганату калію, хлорним вапном або формаліном.

поверхні, у значній кількості переходять в борошно. Тому кількісний і якісний склад мікрофлори борошна залежить від ступеню інфікування зерна, також способів його помелу та очищення. У борошні вищого ґатунку мікроорганізмів менше порівняно з низькосортним борошном з великою кількістю висівок. Загальна кількість мікроорганізмів у1 г борошна може досягати3·106 КУО і

84

тягучу хворобу хліба. Тому для оцінки якості борошна перевіряють наявність у

газоутворювальні бактерії спричиняють спучування і прокисання макаронних

згіркнення, прокисання та пліснявіння непридатне для використання у

походження. Готовий цукор інфікується мікроорганізмами у процесі його очищення, сушіння, пакування та зберігання, особливо за підвищеної вологості продукту. Вміст мікроорганізмів у цукрі порівняно незначний і за стандартної вологості (0,15 %) становить від 50 до 100 КУО в 1 г. За підвищеної вологості, наявності сторонніх домішок чи забруднення кількість мікроорганізмів у цукрі може сягати 104 КУО/г.

У сухому цукрі виявлені мезофільні і термофільні спороутворювальні бактерії, а також лейконосток, осмофільні дріжджі та міцеліальні гриби. У вологому цукрі переважають міцеліальні гриби.

Наявність сторонньої мікрофлори в цукрі є особливо небезпечною для харчових виробництв, які використовують цукор як сировину. У кондитерській промисловості газоутворювальні бактерії і дріжджі призводять до спучування і розтріскування цукерок; осмофільні дріжджі, спороутворювальні термофільні і мезофільні аероби і анаероби спричиняють бродіння і закисання фруктових пюре, варення, джему.

Цукор-пісок часто є джерелом слизоутворювальних бактерійLeuconostoс mesenteroides, розвиток яких сприяєослизненню фруктових соків, сиропів, квасного сусла, хлібного квасу. Ці бактерії утворюють капсули на поверхні клітин, є досить термостійкими і витримують температуру нагрівання до90 °С, швидко розмножуються за зниженої загальної кислотності. За накопичення 0,7−1 % кислоти лейконосток гине. У виробництві квасу для пригнічення розвитку слизоутворювальних бактерій цукровий сироп необхідно кип’ятити не менше 30 хв і строго дотримуватися санітарно-гігієнічних вимог виробництва.

Для попередження контамінації цукру його необхідно зберігати за відносної вологості не більше 70 %.

85

86

Плісняві гриби потрапляють у кефір з устаткування, з повітря, іноді з неякісної закваски, і за тривалого зберігання продукту можуть розвиватися на

продуктів полягає в дослідженні пастеризованого молока, призначеного для заквашування, закваски, напівфабрикатів і готової продукції. Готову продукцію контролюють, як правило, на наявність бактерій групи кишкової палички, золотистого стафілокока, іноді виявляють плісняву і дріжджі, а за необхідності

– мікроскопуванням не рідше одного разу на п’ять .днівПри епідемічних показах виявляють патогенні мікроорганізми, у тому числі й сальмонели як основні збудники харчових отруєнь. Проби відбирають із продукту після розливно-закупорювального автомата або з пляшки і холодостату.

Для вироблення кефіру необхідно, щоб у заквашеному молоці БГКП були відсутні в 0,3 дм3. У сметані нормується також кількість пліснявих грибів і дріжджів, КУО яких не повинно перевищувати50 у 1 мл продукту. Патогенні мікроорганізми, у тому числі сальмонели, у 25 г кисломолочних продуктів не допускаються.

Пиво. Виробництво пива основане на життєдіяльності дріжджів та проводиться в нестерильних умовах, тому на певних стадіях технологічного процесу можливе інфікування різними мікроорганізмами, які спричиняють

розвиток мікроорганізмів. Псування пива можуть викликати культурні пивні дріжджі, які залишилися у невеликих кількостях у результаті неякісного сепарування або фільтрування. При розвитку в готовому пиві вони утворюють

аромат, роблячи його непридатним до споживання. Основними шкідниками пивоварного виробництва є молочнокислі бактерії(Lactobacillus і Pediococcus),

дикі дріжджі, які відрізняються за деякими фізіологічними ознаками від культурних пивних дріжджів. До них належать дріжджі родівSaccharomyces, Brettanomyces, Candida, Hansenula та ін. Активно розмножуючись у готовому пиві, вони викликають суттєві зміни його біохімічних і органолептичних властивостей: з’являються сторонні запахи(фруктово-ефірний, лікарський), неприємний смак та гіркота, утворюється сильне помутніння, осад. Деякі дріжджі, наприклад представники роду Candida, розвиваються на поверхні пива

(показник МАФАМ) та наявність бактерій групи кишкової палички. У 1 мл пива не повинно бути більше 102 КУО сторонніх мікроорганізмів.

87

88