9.Які речовини називаються дезінфікувальними?

10.Які речовини називаються антимікробними?

Лабораторна робота № 7

ВПЛИВ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ НА РІСТ МІКРООРГАНІЗМІВ. ФІЗІОЛОГІЯ РОСТУ МІКРООРГАНІЗМІВ (4 год)

Мета роботи: ознайомлення з дією біологічних факторів на існування мікроорганізмів, особливостями приготування і стерилізації рідких поживних середовищ для вирощування мікроорганізмів, ознайомлення з методами

фотоелектроколориметр, автоклав, компоненти для приготування середовищ (КH2PO4; K2HPO4; (NH4)2SO4; NH4Cl; NaCl; NaOH; MgSO4·7H2O; FeSO4·7H2O; ZnSO4; MnSO4; CaCl2·2H2O, дріжджовий екстракт (автолізат), глюкоза).

Загальні відомості

Дія на мікроорганізми біологічних факторів. Організми в природі існують у тісній взаємодії один з одним. Форми їх взаємовідносин можна умовно поділити на дві категорії: симбіотичні та антагоністичні.

С и м б і о з – форма співіснування організмів, у результаті якого обидва симбіонти мають вигоду від спільного існування. Класична форма симбіозу являє собою таку форму співіснування, коли симбіонти в певних умовах не можуть існувати окремо один від одного. Прикладом служить співжиття гриба

рослинами обидва асоціанти отримують користь від співжиття, проте зв’язки між ними є менш міцними, ніж у організмів, які утворюють лишайники. Різновид такого симбіозу називається м у т у а л і з м о м, або к о о п е р а ц і - є ю. І бактерії, і рослина-хазяїн можуть рости та розвиватись самостійно. При

59

співіснуванні бульбочкові бактерії фіксують , азотпродукти азотфіксації надходять до рослини, в результаті чого вона отримує доступні сполуки азоту, а

називається к о м е н с а л і з м о м, у якій симбіонти користуються захистом або поживними речовинами за рахунок макроорганізму, не приносячи йому користі, але й не завдаючи шкоди. Прикладом є взаємовідносини організму людини з нормальною мікрофлорою , наприкладтіла, з сапрофітною мікрофлорою верхніх дихальних шляхів, шкіри, травного тракту.

Симбіотичні взаємовідносини в спільнотах мікроорганізмів можуть проявлятися як синтрофні. Синтрофія – це явище спільного росту двох чи більше видів мікроорганізмів на середовищі, недоступному кожному видові окремо. Якщо стимуляція проявляється в результаті однобічної дії, такий вид взаємовідносин називається с а т е л і т и з м о м. Наприклад, за спільного росту на агаризованому середовищі довкола колоній мікроорганізмів, що синтезують ціанкобаламін, розмножуються мікроорганізми, які цей вітамін не продукують.

Синтрофна взаємодія може проявлятись також у тому, що один вид мікроорганізмів готує підгрунтя для розвитку іншого. Такий тип синтрофії називається м е т а б і о з о м. Метабіоз – форма взаємовідносин, у якій продукти метаболізму одного мікроорганізму є субстратом(поживним чи енергетичним) для іншого. Так, нітрифікуючі бактерії родуNitrosomonas, окиснюючи аміак до нітритів, забезпечують енергетичним субстратом бактерії роду Nitrobacter.

С и н е р г і з м – форма співіснування мікроорганізмів, у якій у асоціантів взаємно посилюються фізіологічні функції і виникають нові властивості. Прикладом є співіснування оцтовокислих бактерій і дріжджів(“чайний гриб”).

використовуються дріжджами. Дріжджі синтезують вітаміни і забезпечують ними оцтовокислі бактерії.

Антагоністичні взаємовідносини проявляються у пригніченні одного або кількох членів мікробної спільності іншими.

Пасивний (конкурентний) антагонізм – взаємодії, за яких різні мікроорганізми використовують одні й ті самі поживні речовини. Пасивний антагонізм – це конкуренція у боротьбі за їжу та життєвий простір. У цій боротьбі перевагу мають мікроорганізми, яким притаманна висока швидкість росту та невибагливість до джерел живлення.

Активний антагонізм зумовлений виділенням бактерицидних речовин. Ними можуть бути неспецифічні продукти обміну(органічні кислоти, спирти, аміак, феноли та ін.), які спричиняють коагуляцію білків цитоплазми. Так, молочнокислі бактерії, підкислюючи середовище, пригнічують розвиток гнильних бактерій. Причиною активного антагонізму може бути утворення специфічних бактеріостатичних або бактерицидних речовин – антибіотиків, які вибірково діють на інші мікроорганізми. Форма антагонізму, зумовлена

60

середовищі, хоча відомо, що не завжди одне й те саме середовище сприятливе для росту як продуцента, так і тест-культур.

61

Рис. 7.1. Визначення антибіотичної активності методом

перпендикулярних штрихів:

а – схема посіву (1–6 – штрихи тест-культур; 7 – штрих продуцента антибіотичної речовини); б – ріст продуцента і тест-культур

Метод агарових блоків. Цей метод передбачає використання двох різних середовищ для вирощування продуцента антибіотика і тест-організмів. Продуцент антибіотичної речовини засівається суцільним газоном на поверхню агаризованого середовища у чашці Петрі. Після інкубації стерильним корковим свердлом (діаметр 6–8 мм) вирізають агарові блоки з газоном продуцента і переносять їх на поверхню агаризованого середовища(н приклад, МПА), тільки-но засіяного тест-організмом. Агарові блоки розкладають на однаковій відстані один від одного і на відстані 1,5–2 см від краю чашки міцелієм догори і щільно прижимають до поверхні агару. Для кращої дифузії антибіотичної речовини у товщину поживного середовища, засіяного тест-культурою, блоки можна закладати безпосередньо у лунки, попередньо вирізані свердлом. На одній чашці Петрі з тест-організмом можна розмістити4–5 агарових блоків з різними продуцентами антибіотиків (рис. 7.2).

Чашки витримують одну годину при кімнатній температурі для дифузії антибіотичної речовини у товщу агару, потім поміщають у термостат при температурі, оптимальній для росту тест-організму на добу і більше залежно від швидкості його росту. Якщо тест-організм чутливий до антибіотичної речовини продуцента, то після інкубації навкруги агарових блоків утворюються зони відсутності його росту. Чим більше виділяється антибіотика і чим він активніший, тим більшим буде діаметр зони відсутності росту тест-організму. Тест-організм, нечутливий до дії даного антибіотика, росте по всій поверхні середовища і навіть поблизу блоків.

62

б

Рис. 7.2. Визначення антибіотичної активності методом агарових блоків:

а – схема постановки досліду (1–4 – блоки з різними продуцентами); б – зони пригнічення росту тест-культури під дією антибіотика, що дифундує в агар з блоку.

Визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків.

Метод дифузії в агар з використанням паперових дисків. На чашки Петрі з підсушеним м’ясо-пептонним агаром(МПА) суцільним газоном засівають досліджувану культуру мікроорганізмів. Потім стерильним пінцетом на агар накладають індикаторні паперові диски(4−5 штук), насичені розчином певного антибіотика на однаковій відстані один від одного і на відстані близько 2,5 см від центра чашки. Диски нумерують на зворотній стороні дна чашки. Засіяні чашки з нанесеними дисками термостатують при 37 °С упродовж доби. Антибіотики дифундують у товщу агару і попереджають або затримують ріст чутливих до них мікроорганізмів, що проявляється в утворенні навкруги дисків

зони пригнічення росту, що чітко виділяється на фоні суцільного газону досліджуваної культури.

Діаметр зони пригнічення росту визначає ступінь чутлив мікроорганізма до данного антибіотика:

Вимоги до поживних середовищ для вирощування мікроорганізмів.

Основними компонентами мікробної клітини є вода, мінеральні речовини та

63

64

мікроорганізми здатні їх засвоювати.

У природі більшість біологічних елементів містяться у вигляді солей,

Так, сірка, як правило, споживається у вигляді сульфатів, відновлюється до сульфіду і потім використовується в біосинтетичних процесах. Проте певні

Тіобацили і деякі фототрофні бактерії використовують сульфіди, елементну сірку або тіосульфат як донор електронів.

65

Азот необхідний у великих кількостях, оскільки в клітинах його міститься близько 10 %. У природі азот зустрічається у вигляді аміаку, нітрату, нітриту,

організмами. Нітрат спочатку відновлюється до аміаку і тільки після цього використовується в біосинтетичних процесах.

Нітрит є продуктом нітрат-нітритного дихання і метаболічної активності бактерій Nitrosomonas і близьких родів. Нітрит, крім того, може окиснюватись до нітрату бактеріями Nitrobacter. Ряд бактерій здатні фіксувати молекулярний азот і відновлювати його до аміаку. Ця здатність виявлена тільки у прокаріот. І, нарешті, багато які мікроорганізми як джерело азоту використовують органічні сполуки.

Вуглець, водень і кисень можуть споживатися мікроорганізмами у формі органічних та неорганічних сполук(СО2, Н2, H2S, NH3, O2, NO3-, SO42-). Слід зазначити, що жодна з органічних сполук, що утворюються в результаті життєдіяльності різних організмів, на Землі не накопичується. Важливу роль у їх розкладі відіграють мікроорганізми. Велика різноманітність процесів

поживного середовища, багато які мікроорганізми потребують додаткових речовин, які називаються факторами росту. Ці речовини входять до основного складу клітини, але деякі організми не можуть їх самі синтезувати.

кількостях. Амінокислоти, пурини та піримідини входять до складу білків і нуклеїнових кислот, тому клітина потребує їх у достатніх кількостях. Вітаміни входять до складу коферментів або простетичних груп, тобто беруть участь у

а у к с о т р о ф а м и і протиставляються п р о т о т р о ф а м, яким такі фактори росту не потрібні.

Кількість і природа факторів росту різні для різних мікроорганізмів. Для росту молочнокислих бактерій потрібні практично всі амінокислоти, пурини та

66

вітамінах, як біотин, пара-амінобензойна кислота, тіамін, нікотинова кислота і вітамін В12.

Завдання на виконання

1.Аналіз посівів по впливу факторів зовнішнього середовища на ріст мікроорганізмів (лабораторна робота № 6). Ріст мікроорганізмів залежно від температури, рН середовища, концентрації хлористого натрію та глюкози оцінити візуально (за п’ятибальною шкалою), а також визначенням оптичної густини клітинної суспензії(за вирощування на рідкому середовищі) (ФЕК, 540 нм, довжина світлового шляху 5 мм).

2.Провести тестування чутливості бактерій до антибіотиків (методом дифузії в агар з використанням паперових дисків).

3.Приготування рідких поживних середовищ I і II для вирощування дріжджів та бактерій відповідно.

Склад середовища I для вирощування дріжджів(г/л): глюкоза – 20,0; (NH4)2SO4 – 3,0; КH2PO4 – 1,0; K2HPO4 – 0,1; NaCl – 0,5; MgSO4·7H2O – 0,7; FeSO4·7H2O – 0,05; ZnSO4·7H2O – 0,015; MnSO4·4H2O – 0,015; дріжджовий автолізат (екстракт) – 1мл.

Склад середовища II для вирощування бактерій(г/л): глюкоза – 20,0; NH4Cl – 3,5; KH2PO4 – 3,4; NaOH – 1,0; MgSO4·7H2O – 0,4; FeSO4·7H2O – 0,01; CaCl2·2H2O – 0,1; дріжджовий автолізат (екстракт) – 1мл.

Глюкоза готується окремо у вигляді40 %-ного розчину у дистильованій воді, стерилізується при 0,5 атм (30 хв) для попередження карамелізації вуглеводів. Дріжджовий автолізат (екстракт) готується окремо у вигляді5 % розчину у дистильованій воді, стерилізується при 0,5 атм (30 хв) для

попередження розкладання термолабільних факторів . ростуГлюкозу і дріжджовий автолізат (екстракт) вносять у середовища у вигляді стерильних розчинів безпосередньо перед посівом.

Окремо готуються також фосфорвмісні компоненти(для попередження випадання осаду фосфатів кальцію і магнію): середовище I – відповідні концентрації КH2PO4 і K2HPO4 розчиняються у 30 мл дистильованої води, середовище II – відповідні концентрації KH2PO4 і NaOH розчиняються у 30 мл дистильованої води і стерилізуються при 1,5 атм (30 хв).

Решта компонентів обох середовищ розчиняють у70 мл водопровідної води і стерилізують при 1,5 атм (30 хв). Перед посівом стерильні розчини солей (фосфорвмісних компонентів і решти солей) об’єднують.

Залежно від варіанту завдання (див. табл. 7.3), окрім основних середовищ I і II готують поживні середовища без дріжджового автолізату, також

середовища, що містять 50 % глюкози (у два рази меншу кількість глюкози порівняно з основним, тобто 10 г/л), і середовища, які містять лише10 % (десяту частину) джерел фосфору та азоту від їх концентрації в основних середовищах.

67

Контрольні запитання

1.Які особливості притаманні симбіотичним та антагоністичним взаємовідносинам між організмами?

2.Які існують різновиди симбіозу?

3.Що таке синтрофія?

4.Які є форми антагонізму?

68

8.Що таке головні і мінорні біоелементи?

9.Що таке фактори росту?

10.Які мікроорганізми називаються ауксотрофними і прототрофними?

12.У чому полягає суть методу перпендикулярних штрихів?

13.У чому полягає суть методу агарових блоків?

14.Як визначається чутливість мікроорганізмів до антибіотиків?

15.Які речовини називаються антибіотичними?

16.Чому розчини глюкози стерилізуються окремо від інших компонентів поживного середовища?

18.Які режими стерилізації вуглеводів і мінеральних солей?

19.Як можна стерилізувати фактори росту?

Лабораторна робота № 8

РІСТ МІКРООРГАНІЗМІВ У ПЕРІОДИЧНІЙ КУЛЬТУРІ. ВПЛИВ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ НА ПОКАЗНИКИ РОСТУ МІКРООРГАНІЗМІВ (4 год.)

Мета роботи: ознайомлення з особливостями періодичного культивування мікроорганізмів, побудова кривої росту мікроорганізмів залежно від умов культивування мікроорганізмів.

Матеріали та обладнання: спиртівки, бактеріологічні петлі, стерильні піпетки об’ємом 1, 5 і 10 см3, чашки Петрі з ГКА, стерильні пробірки, стерильні колби для вирощування мікроорганізмів, пробірки з стерильною водопровідною водою (по 5 мл), досліджувані культури мікроорганізмів, термостат, качалка, фотоелектроколориметр, кювети (5 мм).

Загальні відомості

Поняття «ріст». Існує кілька визначень поняття «ріст», а саме:

це збільшення біомаси клітини. Проте не всяке збільшення біомаси

69

При поділі поперечною перегородкою цитоплазматична мембрана разом з

мільярд сухих клітин мають масу1 мг, то 472·1019 клітин будуть мати масу 4720 т в умовах, що виключають загибель клітин.

Ріст бактерій у бактеріальній популяції. Методи визначення концентрації бактерій і біомаси. Популяція – це сукупність бактерій одного

70

методам (з використанням відповідного калібрувального графіка). Прямі методи. Існує кілька прямих методів визначення біомаси:

71

сиру біомасу визначають після осадження клітин центрифугуванням. Після висушування відмитих клітин можна визначити суху біомасу;

визначення загального азоту(наприклад, за методом К’єльдаля) або загального вмісту вуглецю (наприклад, за методом Тюріна);

визначення вмісту білка(наприклад, за допомогою біуретового методу,

пов’язаних з ростом (поглинання кисню, утворення СО2).

Ріст бактерій у періодичній культурі. При внесенні бактерій у поживне середовище вони ростуть до тих ,пірпоки вміст якого-небудь необхідного компоненту не стане мінімальним або не вичерпаєтьпісля, чого ріст припиняється. Якщо впродовж всього цього часу в середовище не вносити ніяких поживних речовин і не виводити продукти метаболізму, то одержимо так звану періодичну культуру (популяцію клітин в обмеженому життєвому просторі). Крива, що описує залежність логарифму кількості живих клітин від тривалості культивування, називається к р и в о ю р о с т у (рис. 8.1). Така крива має S-подібну форму, на ній можна виділити кілька фаз росту: початкову (лаг-фазу), експоненційну (логарифмічну), стаціонарну та відмирання. У деяких посібниках на кривій росту виділяють не чотири, а шість фаз (рис. 8.1): лаг-

середовище. У цей період клітини адаптуються до даних умов культивування. Тривалість лаг-фази залежить від передісторії інокуляту та його віку, а також від того, наскільки придатним для росту є дане середовищеі умови

матеріалу, то адаптація до нових умов передбачає синтез нових ферментів, які раніше були непотрібні і тому не синтезувались. Утворення нових ферментів індукується новим субстратом.

Кількісні зміни складу бактеріальної клітини під час лаг-фази стосуються

РНК та ін.). Можна сказати, що культура в експоненційній фазі складається із «стандартних» клітин. Але треба мати на увазі, що і в експоненційній фазі

72

Рис. 8.1. Крива росту бактеріальної популяції. Фази росту: І – лаг-

фаза; ІІ – експоненційна; ІІІ – сповільненого росту; ІV – стаціонарна; V – відмирання; VІ – виживання

клітини періодичної культури зазнають змін, оскільки постійно змінюється середовище: зменшується концентрація субстрату, збільшується густина клітинної суспензії, накопичуються продукти обміну. У зв’язку з тим що в цій фазі швидкість поділу відносно постійна, вона найзручніша для визначення швидкості поділу та швидкості росту. Вплив факторів зовнішнього середовища, складу поживного середовища на ріст мікроорганізміввизначають,

спостерігаючи за показником біомаси чи кількістю клітин саме під час експоненційного росту.

Фаза сповільненого росту. Настання цієї фази зумовлене якісними змінами поживного середовища (споживання поживних речовин, накопичення продуктів метаболізму, дефіцит кисню, зміна рН). Клітина реагує на це зміною інтенсивності синтезу РНК, білка, полісахаридів та інших компонентів.

Стаціонарна фаза. Вона настає тоді, коли кількість клітин перестає збільшуватись, тобто характеризується рівновагою між клітинами, що утворюються, та клітинами, що гинуть. У стаціонарній фазі спостерігається максимальна біомаса і максимальна сумарна кількість клітин.

73

Фаза відмирання. Характеризується зниженням кількості живих клітин, підвищенням гетерогенності популяції. Іноді клітини лізуються під дією своїх власних ферментів (автоліз). Ця фаза досліджена значно менше, ніж попередні.

Фаза виживання. Характеризується наявністю окремих життєздатних клітин в умовах загибелі більшості клітин популяції. Якщо такі клітини пересіяти в свіже поживне середовище, вони починають активно рости та ділитися. Такі виживані клітини характеризуються низькою інтенсивністю процесів метаболізму.

Завдання на виконання

1.Аналіз посівів з визначення чутливості бактерій до антибіотиків

(лабораторна робота № 7).

2.Приготування поживних середовищ. Злити (стерильно) 30 мл розчину фосфорвмісних компонентів і70 мл розчину решти солей, добавити

необхідну кількість (залежно від варіанту) 40 %-ного розчину глюкози і розчину дріжджового автолізату (екстракту) (лабораторна робота № 7).

3.Мікробіологічний контроль поживних середовищ(пункт 2 даної роботи) здійснюється шляхом посіву на чашки Петрі з ГКА(за допомогою бактеріологічної петлі до ізольованих колоній).

4.Приготування посівного матеріалу (інокуляту). Добові (дводобові)

чисті культури бактерій та дріжджів, вирощені в пробірках на МПА та ГКА (СА), залити 5 мл стерильного фізіологічного розчину(або стерильної водопровідної води), суспендувати клітини (змити культуру за допомогою стерильної піпетки чи петлі), суспензію перенести в стерильну пробірку.

5.Засів приготовлених поживних середовищ. Визначити оптичну густину клітинної суспензії посівного матеріалу(за необхідності розбавити дистильованою водою у 10 разів) – ФЕК, 540 нм, довжина світлового шляху 5 мм. Кількість посівного матеріалу становить залежно від варіанту (див. табл. 7.3) 1 та 5 % (об’ємна частка). Після посіву визначити початкову оптичну густину суспензії. 6. Вирощування культур. Залежно від варіанту досліду вирощування культур здійснюється на качалках або в термостаті. Один раз на добу відбирається (стерильно) проба культуральної рідини (2 мл) для аналізу оптичної густини (ФЕК, 540 нм, довжина світлового шляху5 мм).

Вирощування продовжується до зниження приросту біомаси(зниження показника оптичної густини культуральної рідини).

Контрольні запитання

1.Дайте визначення поняття «ріст».

2.Які типи бінарного поділу характерні для грампозитивних грамнегативних бактерій?

3.Що таке онтогенез?

4.Які типи клітинного циклу бактерій Ви знаєте?

5.Що таке бактеріальна популяція?

74