6. Аналіз дріжджів після виділення чистих культур(лабораторна робота № 4, завдання № 3). Мікроскопія культур дріжджів.

Контрольні запитання

1.У чому полягає суть методу накопичувальних культур?

2.Яка культура називається накопичувальною?

3. Які умови необхідно створити для одержання накопичувальних культур хемогетеротрофних бактерій?

4.Як одержати накопичувальні культури хемолітоавтотрофних бактерій?

5.Які особливості притаманні одержанню накопичувальних культур фототрофних організмів?

6. Які умови необхідно створити для одержання накопичувальної культури картопляної палички?

7.Як одержати накопичувальну культуру молочнокислих бактерій?

8.Як одержати накопичувальну культуру маслянокислих бактерій?

Лабораторна робота № 6

ВПЛИВ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ НА РІСТ МІКРООРГАНІЗМІВ ( 4 год.)

Мета роботи: ознайомлення з дією фізичних і хімічних факторів на існування мікроорганізмів, оцінка впливу зовнішніх факторів (рН, температура, концентрація субстрату) на ріст мікроорганізмів.

Матеріали та обладнання: спиртівки, бактеріологічні петлі, предметні і накривні скельця, стерильні піпетки, мікроскопи, досліджувані культури мікроорганізмів, пробірки із скошеним агаризованим середовищем(ГКА), пробірки з м’ясо-пептонним бульйоном (МПБ, значення рН 4, 7 і 9), пробірки з рідким суслом (значення рН 4, 7 і 9), пробірки з рідким суслом і глюкозою (10 і 30 %), пробірки з МПБ і хлористим натрієм(0,5 і 15 %), 5 %-ний розчин хлорного заліза, суміш спирту та ефіру1:1, 96° спирт, розчин метиленового синього за Леффлером, концентрований розчин Люголя, концентрована сірчана кислота, пробірки для відбору проб культуральної рідини.

Загальні відомості

Дія на мікроорганізми зовнішніх факторів

Всі фактори зовнішнього середовища, які впливають на існування мікроорганізмів (їх ріст, розмноження) можна поділити на три групи:

1) фізичні (температура, вологість, осмотичний та гідростатичний тиск, промениста енергія, ультразвук, електрика);

53

2)хімічні (рН середовища, окисно-відновний потенціал, токсичні речовини);

3)біологічні (взаємодія мікроорганізмів між собою, з рослинами, тваринами, людиною).

Фізичні фактори. По відношенню дотемператури мікроорганізми поділяються на психрофіли, мезофіли та термофіли. Для психрофілів оптимальною температурою є5−12 °С, мезофілів − 25−37 °С (у деяких літературних джерелах температурний інтервал росту мезофілів вказаний як

необхідна вода, яка є одночасно і середовищем, і безпосереднім учасником багатьох біохімічних реакцій у клітині. Вода необхідна мікроорганізмам для розчинення в ній поживних речовин(мінеральних солей та органічних речовин). Велика роль води в процесі дихання. Вода, що міститься по

реакцій і мікроорганізмів визначаютьпоказником активності водиaw, що характеризує ступінь зв’язаності її молекул. Активність чистої вільної води дорівнює одиниці. При взаємодії води з поверхнями, аніонами і катіонами, будь-якими гідрофільними групами активність води стає меншою за одиницю.

Мікроорганізми можуть рости на середовищах зі значеннямиa =0,99 – 0,60.

w

Іноді для визначення ступеня доступності води користуються показником відносної вологості (виражається у відсотках). Обидва параметри відносяться до фази пари, яка перебуває у рівновазі з твердим матеріалом чи розчином. Активність води (відносна вологість) – це відношення концентрації води у фазі

пари в повітряному просторі над даним матеріалом до концентрації води в повітрі над чистою водою при певній температурі.

Водна активність розчину може змінюватися двома шляхами–матричним і осмотичним. Осмотична зміна aw відбувається в результаті взаємодії молекул води з розчиненими речовинами. Матрична зміна aw зумовлена адсорбцією молекул води на поверхнях твердих субстратів. Часто вважають, що вплив

концентрації розчинів на ріст мікроорганізмів опосередкований впливом осмотичного тиску. У дійсності цей вплив позначається на зміні водної активності як міри доступної для організму води.

Мікроорганізми, які ростуть у середовищах з високими концентраціями речовин, називають о с м о т о л е р а н т н и м и. Це деякі види дріжджів, що розмножуються у варенні, меді, а також бактерії– в солоній рибі. Деякі мікроорганізми є о с м о ф і л ь н и м и. Вони не тільки витримують середовище з підвищеною концентрацією речовин, а й віддають йому перевагу. Є група

Галофіли існують у найбільш солоних морях та озерах(Мертве, Каспійське море).

54

55

56

амінобензойної кислоти, яка в свою чергу входить до складу коферменту тетрагідрофолієвої кислоти. У більшості бактерій тетрагідрофолієва кислота синтезується з простіших компонентів. Коли сульфонамід проникає в клітину, він включається у фолієву кислоту. При цьому утворюється кофермент, який нездатний функціонувати, в результаті чого ріст припиняється;

пригнічення синтезу білка антибіотиками. Дія антибіотиків у прокаріот направлена на функцію70S рибосом. Стрептоміцин та неоміцин гальмують процес зв’язування амінокислот, еритроміцин порушує функцію субодиниці 50S. Хлорамфенікол (левоміцетин) пригнічує включення амінокислот у білки;

пригнічення синтезу нуклеїнових кислотантибіотиками. Мітоміцин С перешкоджає синтезу ДНК, актиноміцин Д порушує синтез РНК, ріфампіцин діє на ДНК-залежну РНК-полімеразу і тим самим пригнічує синтез матричної РНК у бактерій;

гальмування синтезу клітинних стінок. Синтез пептидоглікану пригнічується пеніциліном, цефалоспоринами, бацитрацином.

Завдання на виконання

1. Продовження роботи з одержання накопичувальних культур

(лабораторна робота № 5, завдання № 1–3).

1.1. Дослідження морфологічних особливостей картопляної палички.

Після інкубування на картоплі проростають спори і утворюється міцна зморщена плівка, за мікроскопування якої видно рухливі палички завдовжки до 4–5 мкм, часто з‘єднані у ланцюжки. Приготувати препарат фіксованих клітин, промікроскопувати, замалювати.

1.2. Дослідження морфологічних особливостей молочнокислих бактерій.

Після інкубації накопичувальної культури молочнокислих бактерій відзначають згортання молока, характер росту мікроорганізмів (утворення згустка – щільного, рихлого, слизового) і газоутворення.

Приготувати препарат фіксованих клітин, мікроскопувати, замалювати. Враховуючи особливість субстрату(молоко), препарат фіксованих клітин готують так. На предметне скельце з пробірки нанести краплю культуральної рідини, яку рівномірно розмазати накривним скельцем. Мазок висушити на повітрі, фіксувати і одночасно знежирити сумішшю спирту та ефіру(1:1) упродовж 10 хв, яку безпосередньо наносити на мазок. Після випаровування суміш налити повторно. Висушений мазок фарбувати розчином метиленового синього за Леффлером.

1.3. Дослідження морфологічних особливостей маслянокислих бактерій. Для приготування мікроскопічного препарату культуральну рідину з дна

пробірки (біля шматочків картоплі) відбирають піпеткою. Приготувати препарат фіксованих клітин, мікроскопувати, замалювати. При мікроскопуванні видно велику кількість рухливих паличок.

1.4. Дослідження фізіологічних особливостей маслянокислих бактерій (виявлення масляної кислоти у культуральній рідині і гранульози у клітинах).

57

Виявити масляну кислоту у культуральній рідині можна за двома якісними реакціями:

–у суху чисту пробірку внести3–5 мл культуральної рідини, взятої з середини пробірки з накопичувальною культурою, добавити 1–2 мл 5 %-ного розчину хлорного заліза, трохи підігріти і спостерігати появу оранжево-бурого забарвлення в результаті утворення маслянокислого заліза;

–у суху чисту пробірку внести3–5 мл культуральної рідини, взятої з

середини пробірки з накопичувальною культурою, добавити 1–2 мл 96 º спирту, 1 мл концентрованої сірчаної кислоти. Після охолодження пробірки виявляють ананасовий запах утвореного масляноетилового ефіру.

Відмінною рисою маслянокислих бактерій є здатність накопичувати у клітинах запасну речовину – гранульозу. Для виявлення гранульози в клітинах маслянокислих бактерій на предметне скельце нанести краплю культуральної

2. Вплив умов культивування на ріст мікроорганізмів.

2.1.Здійснити посів бактерій у пробірки з МПБ та дріжджів у пробірки з рідким солодовим суслом з різним значенням рН(4, 7, 9). Пробірки з засіяним середовищем інкубувати у термостаті при температурі, оптимальній для росту досліджуваних мікроорганізмів.

2.2.Провести посів культури дріжджів у три пробірки з агаризованим середовищем. Одну пробірку інкубувати при температурі+ 4 °С, другу – + 30 °С, третю – + 38 °С.

2.3.Здійснити посів бактерій у пробірки з МПБ і різною концентрацією хлористого натрію (0,5 і 15 %). Пробірки з засіяним середовищем інкубувати у

2.4. Провести посів дріжджів у пробірки з рідким солодовим суслом і різною концентрацією глюкози (10 і 30 %). Пробірки з засіяним середовищем інкубувати у термостаті при температурі, оптимальній для росту досліджуваних мікроорганізмів.

Контрольні запитання

1.Які зовнішні фактори впливають на ріст мікроорганізмів?

2.Як поділяються мікроорганізми по відношенню до температури?

3.Які мікроорганізми називаються барота осмотолерантними?

4.Як впливає на мікроорганізми промениста енергія?

5.Як поділяються мікроорганізми по відношенню до рН?

6.Як поділяються мікроорганізми по відношенню до кисню?

7.Як впливають на мікроорганізми хімічні речовини?

8.Що означають терміни«бактеріостатична дія», «бактерицидна дія», «фунгістатична дія», «фунгіцидна дія»?

58