Лабораторна робота № 3

ТЕХНІКА ПОСІВУ І ПЕРЕСІВУ. МЕТОДИ ВИДІЛЕННЯ ЧИСТИХ КУЛЬТУР МІКРООРГАНІЗМІВ

( 4 год.)

Мета роботи: ознайомлення з можливостями методу скануючої зондової мікроскопії для аналізу біополімерів, типами поживних середовищ для вирощування мікроорганізмів, методами стерилізації середовищ і посуду, методами культивування аеробних і анаеробних мікроорганізмів, опанування методів посівів і пересівів мікроорганізмів на агаризовані і рідкі середовища, а також методів виділення чистих культур мікроорганізмів.

Матеріали та обладнання: спиртівки, бактеріологічні петлі, стерильні піпетки, чашки Петрі з агаризованим середовищем(сусло-агар), пробірки з рідким суслом, культури дріжджів Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycoides ludwigii, Shizosaccharomyces pombe, Candida scottii, Rhodotorula glutinis, Trichosporon cutaneum, вирощені на СА і рідких середовищах, суспензія суміші двох дріжджових культур, термостат.

Загальні відомості

Використання методу скануючої зондової мікроскопії для аналізу біополімерів. Зондові мікроскопи широко використовуються в дослідженнях багатьох біологічних об’єктів: нуклеїнових кислот, білків, білок-мембранних комплексів і ліпополісахаридів. У кожному конкретному випадку важливо підібрати адекватну методику приготування зразка для іммобілізації досліджуваних структур на підкладці, матеріал якої можна варіювати залежно від поставленої мети. Традиційно в якості субстрату використовують підкладки із слюди, графіту та інших шарових матеріалів, різне скло, полімерні матеріали і металеві поверхні, плівку із сплаву золото-паладій, неіонні чи катіонні

28

біологічних та синтетичних макромолекул відкриває нові перспективи для

ферментативну активність.

Зрозвитком експериментальної техніки АСМ досягнуто значних успіхів і

вдослідженні структури та структурних змін мембранних білків: візуалізовано просторову двомірну решітку бактеріородопсину у пурпурових мембранах в буферному розчині, визначено товщину пурпурової мембрани та прослідковано її залежність від рН розчину, вивчено процеси утворення білкових кластерів у фосфоліпідних шарах на твердій підкладці.

Атомно-силова мікроскопія широко застосовується для вивчення білків у кристалічному вигляді. Так, вдалося спостерігати процес росту кристалів лізоциму, канаваліну і тауматину. АСМ на сьогодні є єдиним методом, що дозволяє досліджувати формування білкових кристалів, утворення дефектів, швидкість росту і її залежність від направлення на рівні окремих молекул. Кристал білка, в свою чергу, є модельною системою для вивчення кристалів будь-якої природи.

Крім прямої візуалізації біологічних структур методом АСМ можливо також вимірювати сили міжмолекулярної взаємодії. Вперше виміряно силу

Основними перевагами цього методу, порівняно з електронною мікроскопією, є можливість вивчення реальної поверхні клітини без застосування спеціальних методів підготовки зразків, проведення досліджень живих бактерій на повітрі чи рідких середовищах, висока просторова роздільна здатність та одночасне дослідження локальних властивостей клітинної стінки, в тому числі жорсткості, пластичності та адгезивності.

29

При зміні пружних властивостей бактеріальної стінки можна отримувати інформацію про внутрішню будову клітини. Так, за допомогою АСМ зареєстровано зміни структури ліпополісахаридів клітинної стінки бактерій Escherichia coli, що успадковують генетичну детермінанту, відповідальну за контроль синтезу первинних бокових ланцюгів дизентерійних бактерій. Продемонстровано можливість спостереження динамічних змін у структурі бактерій, зокрема, утворення мікропор у бактеріальній стінці при впливі іонів кальцію. Здійснено візуалізацію бактеріальних клітин Escherichia coli, Klebsiella

медичних виробів, при створенні контактних лінз з антибактеріальними

елементи, з яких будується клітина, причому в доступній для засвоєння організмом формі. Такими основними компонентами поживного середовища повинні бути: джерело вуглецю та енергії, джерела мінеральних сполук (азот, фосфор, сірка, калій, магній, кальцій, залізо та мікроелементи), а також (у разі потреби) й фактори росту.

За складом середовища поділяються на дві групи: с нтетичні та

натуральні (складні).

Якщо поживний розчин складений з певних хімічнихсполук, то таке середовище називається с и н т е т и ч н и м. Дослідник намагається визначити

необхідні для росту. Більш вимогливі види потребують більшої кількості

30

належать м’ясо-пептонний бульйон з глюкозою та фосфорнокислим калієм, картопляне середовище з глюкозою та пептоном.

За призначенням розрізняють елективні та диференційно-діагностичні

середовища. Елективні забезпечують переважний розвиток одного виду або групи мікроорганізмів і менш придатні (зовсім непридатні) для розвитку інших.

Прикладами сипких середовищ є розварене пшоно, висівки, кварцевий пісок, насичені поживним розчином.

Для виготовлення щільних середовищ, на яких мікроорганізми ростуть у вигляді колоній, до рідких поживних розчинів добавляють речовини, які надають їм гелеподібної консистенції. Желатину використовують дуже рідко, оскільки вона має низьку температуру плавлення– (26–30 °С) і, крім того, розкладається багатьма мікроорганізмами. Майже ідеальним засобом для одержання щільних середовищ є , агарякий В.Гессе, німецький лікар, співробітник Р.Коха, ввів у бактеріологічну практику у1883 р. Концентрація агару становить 15–20 г/л. Агар – це полісахарид, який виділяють з червоних морських водоростей. Його розчини плавляться при100 °С, а при 44 °С перетворюються на твердий прозорий гель. Розкладати агар здатні тільки деякі бактерії. Якщо потрібні щільні середовища, які не містять органічних речовин,

супроводжуються, як правило, загибеллю клітин, у певних умовах можуть бути оборотними. Наприклад, явище фотореактивації після опромінення культури ультрафіолетом.

Стерилізація (знепліднення) – це звільнення будь-якого матеріалу від живих мікроорганізмів або їх форм спокою(спор). Від стерилізації слід відрізняти часткове знепліднення (пастеризацію), а також консервування. Якщо у стерильне середовище чи мікробну культуру потрапили інші мікроорганізми,

мікроорганізмів, характеризують величиною D10 (час, необхідний для загибелі 90 % клітин певної популяції у певних умовах).

Існують такі методи стерилізації: фізичні, хімічні та механічні.

Фізичні методи стерилізації(стерилізація нагріванням) найчастіше використовуються у мікробіологічній практиці.

Стерилізація прожарюванням у полум’ї пальника. Так стерилізують дрібні лабораторні інструменти, препарувальні голки, бактеріологічні петлі, скляні палички, пінцети та ін. Після прожарювання охолоджені предмети не можна класти на стіл; їх слід тримати так, щоб вони не торкалися інших предметів.

Стерилізацію дрібних інструментів(голки, шприци тощо) можна здійснювати кип'ятінням у стерилізаторах упродовж 30 хв.

31

Стерилізація сухим жаром здійснюється в електросушильних шафах при

Простерилізований посуд слід виймати з шафи після ,тогояк температура знизиться до 50−70 °С, оскільки за різкого охолодження може тріснути скло і

залежить від температури, а не від тиску. Тому під час автоклавування слід вимірювати температуру, а не тиск, хоча зважаючи на простоту та безпеку вимірюють тиск. Температура та тривалість стерилізації залежать від складу поживного середовища. Так, молоко, желатинові середовища та середовища, які містять цукри, вітаміни тощо стерилізують при температурі112–115 °С і тиску 0,05 МПа впродовж 20–30 хв, м’ясо-пептонні середовища – при 120 °С (0,075–0,1 МПа) упродовж 20–30 хв, розчини солей – при 131 °С (0,15 МПа) увпродовж 40–60 хв.

Стерилізація текучою пароювикористовується для середовищ, що містять речовини, які змінюються під дією температури понад100 °С. Її здійснюють в автоклаві з незагвинченою кришкою за відкритого крану для виходу пари або в спеціальному апараті.

Текучою парою здійснюють дробну стерилізацію, котра проводиться при 100 °С протягом 2−3 днів підряд упродовж 30−40 хв щоденно. У проміжках між стерилізацією поживні середовища залишають при18−20 °С або витримують у термостаті для проростання спор, які залишилися після кип’ятіння.

Пастеризація – неповна стерилізація, що здійснюється нагріванням до 50−60 °С упродовж 15−30 хв чи до 70−80 °С упродовж 5−10 хв з наступним охолодженням до 10−11 °С. Використовується для інактивації вегетативних клітин мікроорганізмів у рідинах, що не витримують високої температури (молоко, пиво, соки тощо). Оскільки за пастеризації спорові форми виживають, то для унеможливлення проростання спор пастеризовані продукти зберігаються на холоді.

Тиндалізація – дробна стерилізація нагріванням, що здійснюється кілька

32

камер для посівів.

матеріалів. Вони являють собою диски завтовшки0,1 мм і діаметром 35 мм. Використовують мембранні фільтри з різним діаметром пор, що дає можливість затримувати на них організми різної величини та форми.

Стерилізація фільтруванням за допомогою фільтра Зейтца. Фільтри Зейтца являють собою щільні диски, виготовлені з суміші азбесту і целюлози.

Культивування аеробних і анаеробних мікроорганізмів. Для аеробних мікроорганізмів, які ростуть на агаризованих середовищах, кисню достатньо. У рідких середовищах за великого об’єму рідини аеробні бактерії можуть рости тільки на поверхні, оскільки з віддаленням від поверхні умови наближаються до анаеробних. Для нормального росту аеробів у глибоких шарах рідкої культури необхідна аерація. Мікроорганізми здатні використовувати тільки розчинений кисень, але розчинність його дуже низька. Так, 1 л води при 20 °С за умови рівноваги з атмосферним повітрям містить усього6,2 мл кисню (0,28 ммоль). Такої кількості кисню достатньо для окиснення всього8,3 мг глюкози (тобто однієї тисячної від загальної кількості глюкози, яка міститься в нормальному поживному середовищі).

Швидкість розчинення кисню підвищується у разі збільшення поверхні розділення між газовою та рідкою фазою, а також із збільшенням парціального

рідини струшуванням (пряме чи кругове); обертання посудини, що лежить, навколо поздовжньої осі; пропускання повітря через рідину за допомогою газорозподільника (скляні фільтри, колби Клюйвера); механічне перемішування.

Вирощування анаеробних культур. При вирощуванні строго анаеробних культур необхідно виключити доступ кисню. Техніка анаеробних культур передбачає:

33

одновалентної міді); внесення в середовище відновників(аскорбінова кислота, тіогліколят,

цистеїн або навіть сульфід, якщо організм його переносить); безперервне продування азоту чи інертного газу (наприклад аргону) через

культуральні посудини (навіть при посіві на повітрі можна запобігти контакту середовища з повітрям). Це так звана техніка Хангейта;

використання анаеробних боксів, заповнених азотом, воднем, аргоном; застосування кольорових індикаторів (резазурин у присутності кисню має

рожеве забарвлення, в анаеробних умовах безбарвний; метиленова синька в анаеробних умовах також знебарвлюється).

Техніка посіву та пересіву. У лабораторних умовах мікроорганізми вирощують на агаризованих і рідких середовищах, які розливають у пробірки, колби, матраци та чашки Петрі(рис. 3.1). Посуд та поживні середовища попередньо стерилізують.

Рис. 3.1. Посуд для культивування мікроорганізмів:

1 – качалочна колба; 2 – качалочна колба з відбійниками; 3 – конічна колба; 4 – чашка Петрі; 5 – матрац

Посівом у мікробіології називають внесення клітин мікроорганізмів (посівного матеріалу, інокуляту) у стерильні середовища.

34

Пересів мікроорганізмів, вирощених на агаризованому середовищі у пробірках, в інші пробірки з агаризованим середовищем:

–на пробірці із свіжим поживним середовищем розбірливо підписують назву мікроорганізму і дату пересіву;

–запалюють спиртівку. Посіви (пересіви) здійснюють над полум’ям спиртівки, щоб тепле повітря перешкоджало осадженню мікроорганізмів з навколишнього повітря і частково знищувало їх;

–беруть у праву руку бактеріологічну петлю, за допомогою якої здійснюють посів (петлю тримають як олівець);

–стерилізують бактеріологічну петлю у полум’ї спиртівки, прожарюючи дріт докрасна, і одночасно обпалюють частину держака, котра вводитиметься у пробірку з культурою мікроорганізму. Під час прожарювання петлю тримають

уполум’ї майже вертикально, щоб увесь дріт був прогартований;

–беруть у ліву руку дві пробірки(рис. 3.2): одну із стерильним середовищем (далі від себе), другу із культурою мікроорганізму(ближче до себе);

–не випускаючи бактеріологічної петлі з правої , рукимізнцем і безіменним пальцем правої руки притискають зовнішні кінці ватних корків до долоні і виймають корки з пробірок. Класти корки на стіл не можна;

–трохи обпалюють у полум’ї спиртівки краї відкритих пробірок;

–вводять у пробірку з культурою мікроорганізму петлю. Щоб не

пошкодити клітини мікроорганізму, петлю спочатку охолоджують, дотикаючись до внутрішньої поверхні пробірки чи до поживного середовища, вільного від клітин мікроорганізму, і тільки після цього відбирають невелику кількість мікробної маси;

–виймають петлю і вводять її у пробірку із стерильним поживним середовищем, уникаючи дотику до стінок пробірки;

–проводять петлею від дна до верху зигзагоподібну лінію-штрих, ледь дотикаючись до поверхні агару;

–одночасно обпалюють ватні корки і краї пробірок і закривають обидві пробірки;

–обпалюють петлю у полум’ї;

– пробірки поміщають у термостат для вирощування мікроорганізмів при температурі, оптимальній для їхнього росту.

35

Рис. 3.2. Пересів культури мікроорганізму

Пересів культур мікроорганізмів, вирощених у рідкому середовищі:

–беруть у ліву руку пробірку(чи колбу) з культурою мікроорганізму, вирощеного у рідкому середовищі, і тримають її вертикально, щоб не замочити корок;

–відкривають корок, дотримуючись правил стерильності, наведених вище, і вводять піпетку у пробірку;

–набирають у піпетку суспензію мікроорганізму, закривають пробірку (чи колбу) корком, вносять певну кількість суспензії у свіже стерильне поживне середовище;

–піпетку поміщають у посудину з дезінфікувальним розчином(0,5–3 % водний розчин хлораміну чи 3–5 % водний розчин фенолу), не торкаючись нею навколишніх предметів;

36

– посіви поміщають у термостат для вирощування мікроорганізмів при температурі, оптимальній для їхнього росту.

Посів на агаризовані середовища у чашки Петрізд йснюється поверхневим або глибинним способами.

Поверхневий спосіб посіву – на поверхню середовища петлею чи піпеткою наносять краплю посівного матеріалу і рівномірно розподіляють його по поверхні (петлею чи шпателем):

–шпатель виймають з стерильного паперу і беруть у праву руку;

–у ліву руку беруть чашку Петрі з агаризованим середовищем, привідкривають кришку лівою рукою і вносять шпатель;

–розмазують краплю посівного матеріалу шпателем по поверхні агаризованого середовища обертовими рухами(надавлювати шпателем на середовище не можна, щоб не пошкодити його);

–переносять шпатель у посудину з дезінфікувальним розчином;

–чашки поміщають у термостат для вирощування мікроорганізмів при температурі, оптимальній для їхнього росту.

Глибинний спосіб посіву:

–привідкривають стерильну чашку Петрі і поміщають на дно петлею чи піпеткою краплю посівного матеріалу;

–розплавлене і охолоджене до45–48 °С агаризоване середовище з дотриманням правил асептики вносять у чашку Петрі з посівним матеріалом;

–рівномірно розподіляють посівний матеріал у поживному середовищі,

для чого обережно обертовими рухами переміщають чашку Петрі по поверхні стола;

–залишають чашку Петрі на столі до повного застигання середовища;

–підписують чашку Петрі (число і назва мікроорганізму) і поміщають у термостат для вирощування мікроорганізмів при температурі, оптимальній для їхнього росту.

37

клітини. Потім на поверхню стерильного скла за допомогою простерилізованої голки і скляної палички наносять ряди дрібних крапель середовища, що містить мікроорганізми.

Скло перевертають і помішають над лункою предметного скельця. Краї лунки попередньо змащують вазеліном. Далі усі краплі проглядають у мікроскопі і відзначають ті з них, в яких міститься лише одна клітина.

Скло поміщають у чашку Петрі, на дні якої міститься зволожений

38

Тривалість вирощування становить зазвичай 2–3 доби, в результаті на поверхні середовища виростають колонії мікроорганізмів.

Рис. 3.3. Розсів культури мікроорганізмів на поверхню щільного

середовища методом виснаженого мазка:

а – шпатель Дригальського; б – розсів; в – ріст мікроорганізмів після розсіву

Рис. 3.4. Схема послідовності (1–5) розсіву культури мікроорганізмів

на поверхню щільного середовища методом виснаженого штриха

На рис. 3.5 наведено зручний метод посіву «до ізольованих колоній» (модифікація методу виснаженого штриха). Слід зазначити, що саме цей метод практично завжди дає змогу одержати ізольовані колонії, навіть за відсутності навичок у експериментатора. Спочатку на зворотній стороні чашки Петрі маркером (олівцем) наносять букву Т, що розділяє дно чашки на три сектори (рис. 3.5, А). Далі (рис. 3.5, Б) петлею з культурою зигзагом наносять штрихи по поверхні середовища у секторі1. Для цього кришку чашки спочатку привідкривають, а після нанесення штриха відразу ж закривають. Петлю стерилізують у полум’ї і дають їй охолонути( 15 с). Проводять петлею по

39

поверхні середовища у секторі 1 і відразу ж наносять нею штрихи на поверхні середовища у секторі2 (рис. 3.5, В). Прогрівають петлю у полум, ’ї охолоджують. Далі (рис. 3.5, Г) проводять петлею по поверхні середовища у секторі 2 і наносять нею штрихи на поверхні середовища у секторі3. Засіяні чашки перевертають догори дном і інкубують при температурі, оптимальній для даного мікроорганізму. У секторі 1 виростає велика кількість колоній, тоді як у секторах 2 і 3 з’являються окремі добре ізольовані колонії (рис. 3.5, Д).

Рис. 3.5. Модифікація методу виснаженого штриха

для одержання ізольованих колоній мікроорганізмів

40

2.Провести пересів культур дріжджів, вирощених на рідкому поживному середовищі (рідке сусло), у стерильне рідке поживне середовище. Пробірки з засіяним середовищем інкубують у термостаті при температурі25–26 °С упродовж 1–2 діб.

3.Виділити чисті культури дріжджів(метод виснаженого штриха) з вихідної суспензії (суміш з двох культур дріжджів). Чашки Петрі з культурами дріжджів інкубують у термостаті при температурі 25–26 °С упродовж 1–2 діб.

Контрольні запитання

1.Охарактеризуйте типи поживних середовищ для вирощування мікроорганізмів.

2.Що таке стерилізація?

3.Охарактеризуйте фізичні методи стерилізації.

4.Як стерилізують у лабораторній практиці поживні середовища і посуд?

5. Які режими автоклавування Ви знаєте? Для стерилізації яких середовищ і речовин вони застосовуються?

6.Чим відрізняється пастеризація від тиндалізації?

7.Охарактеризуйте хімічні методи стерилізації.

8.Які особливості притаманні культивуванню аеробних і анаеробних мікроорганізмів?

9.Що означають терміни «посів» і «пересів» культур мікроорганізмів?

10.Як здійснюється пересів мікроорганізмівз агаризованого на агаризоване середовище у пробірки?

11.Як здійснюється пересів на агаризовані середовища мікроорганізмів, вирощених на рідких середовищах?

12.Які особливості притаманні поверхневому і глибинному посіву мікроорганізмів на агаризовані середовища у чашки Петрі?

13.Що таке чиста культура?

14.Які методи виділення чистих культур Ви знаєте?

15.В чому полягає суть методу розбавлення і крапельного методу для виділення чистих культур?

16.Охарактеризуйте метод Коха для виділення чистих культур.

17.У чому полягає суть методу«виснаженого» штриха і «виснаженого» мазка для виділення чистих культур мікроорганізмів?

18.Як здійснюється посів на чашки Петрі до «ізольованих колоній» ?

41