Лабораторна робота № 4

МЕТОДИ КІЛЬКІСНОГО ОБЛІКУ МІКРООРГАНІЗМІВ

( 4 год.)

Мета роботи: ознайомлення з методами кількісного обліку мікроорганізмів, опанування методу Коха.

Матеріали та обладнання: спиртівки, бактеріологічні петлі, камери Горяєва, предметні і накривні скельця, шпателі Дригальського, мікроскопи, чашки Петрі з агаризованим середовищем, досліджувані дріжджові культури, розчин Люголя, розчин метиленового синього за Леффлером, 1 %-ний розчин сірчаної кислоти, термостат.

Загальні відомості

Методи кількісного обліку мікроорганізмів. Відомі такі методи кількісного обліку мікроорганізмів: метод Коха (найуживаніший у лабораторній практиці), прямий підрахунок клітин за допомогою лічильних камер, облік на фіксованих препаратах.

Метод Коха. Суть методу полягає у висіві певного об’єму досліджуваної суспензії на агаризоване середовище (у чашки Петрі) з наступним підрахунком кількості колоній, що виросли. Цей метод дає змогу здійснювати облік тільки життєздатних клітин.

Для аналізу в асептичних умовах відбирають1 мл клітинної суспензії і поміщають у 9 мл стерильної водопровідної води або фізіологічного розчину (рис. 4.1), потім послідовно новою піпеткою переносять по1 мл у ряд пробірок з 9 мл стерильної водопровідної води.

Ступінь розведення визначається передбачуваною кількістю клітин у зразку. Кількість розведень тим більша, чим більше мікроорганізмів міститься у вихідному зразку.

З одержаних (попередньо ретельно перемішаних) розведень здійснюють висів на поверхню агаризованого середовища у чашки Петрі. Висів здійснюють

підрахованих колоній: кращим розведенням вважають таке, за умови висіву з якого на агаризованому середовищі виростає від 50 до 150 колоній.

Знаючи кількість колоній і ступінь розведення, визначають кількість мікроорганізмів за формулою:

42

де N – кількість мікроорганізмів в 1 мл суспензії; К − розведення, з якого здійснено висів; а − середня кількість колоній на чашці Петрі за розведенняК; V − об‘єм суспензії, взятий для посіву, мл; 2 − критерій при9 % рівні значущості; σ − середнє квадратичне відхилення, рівне ± åa /n, n − кількість

повторностей.

Рис. 4.1. Схема приготування розбавленої суспензії

мікроорганізмів і посіву (метод Коха)

Облік за допомогою лічильних камер. Відомі лічильні камери різних

об’єктів − клітин водоростей, дріжджів, спор грибів.

Лічильна камера являє собою товсте предметне скло з нанесеними на ньому поперечними прорізями, що утворюють три поперечно розміщені плоскі площадки (рис. 4.2, а). Середня площадка поздовжньою проріззю розділена навпіл, причому на кожній половині нанесена квадратна сітка. Дві бокові площадки розміщені на0,1 мм вище середньої(рис. 4.2, б). Ці площадки служать для притирання накривного скельця. Сітка розділена на певну кількість

43

великих і малих квадратів, згрупованих по-різному (рис. 4.2, в). Постійною величиною у всіх сітках є малий квадрат(ABCD, рис. 4.2, в), сторона якого дорівнює 1/20 мм, площа − 1/400 мм2, а об’єм за висоти камери1/10 мм − 1/4000 мм3 або 1/4000000 мл. Так званий великий квадрат ABCD складається з 16 малих квадратів.

Камера Горяєва має площу9 мм2, об’єм камери становить 9 мм3. Камера розбита на 225 великих квадратів (15 рядів по 15 великих квадратів у кожному ряду) (рис. 4.2, в).

Рис. 4.2. Лічильна камера Горєва:

а – вигляд зверху; б – вигляд збоку; в – вигляд за малого збільшення мікроскопу

Краплю суспензії наносять на сітку камери і зверху накривають чистим накривним скельцем. Рідина під накривним скельцем повинна рівномірно без бульбашок розподілитися по всій сітці, не виступаючи у жолобок між стінками. Великими пальцями накривне скельце щільно притирають до бокових площадок камери до появи ньютонівських кілець.

Камеру з досліджуваним матеріалом поміщають на предметний столик мікроскопа і мікроскопують з об'єктивом10−40х (у полі зору повинні бути чітко видні як квадрати, так і мікроорганізми). Підраховують кількість клітин у п’яти великих квадратах(тобто 180 малих), розміщених по діагоналі. Враховують всі клітини, розміщені всередині квадрата і на пограничних лініях, якщо вони більшою частиною лежать всередині квадрата. Клітини, розділені

44

Визначають середню кількість клітин в одному квадраті. Припустимо, у п'яти великих квадратах (80 малих) міститься 240 клітин, тоді в одному малому квадраті середня кількість клітин становить240:80=3. Перерахунок на 1 мл суспензії iз врахуванням розведення здійснюють за формулою:

малому квадраті; h − глибина камери, мм; S − площа малого квадрата, мм2; K − розведення вихідної суспензії; 1000 − коефіцієнт перерахунку мм3 у мл (1 мл = 1000 мм3).

Облік мікроорганізмів на фіксованих препаратах. Суть методу полягає в тому, що в певному об’ємі досліджуваної суспензії підраховують кількість клітин мікроорганізмів безпосередньо у мікроскопі. Використання фіксованих

мазків дає змогу зберігати препарати упродовж тривалого часу і здійснювати підрахунок не тільки у процесі досліду, а й у інший час.

Для проведення кількісного обліку готують фіксований препарат. Для цього певний об’єм досліджуваної суспензії(зазвичай 0,02−0,05 мл) наносять мікропіпеткою на знежирене сухе предметне скло, поміщене на міліметровий папір з окресленою площею у4 або 6 см2. У краплю суспензії добавляють краплю стерильного 0,03 %-ного водного розчину агар-агару, швидко перемішують стерильною бактеріологічною петлею і рівномірно розподіляють на площі, відзначеній на папері. Мазок висушують на повітрі, фіксують 20−30 хв 96° спиртом і фарбують фуксином основнимчи метиленовим синім упродовж 2 хв, після чого обережно промивають у кристалізаторі з водою. Готовий препарат висушують на повітрі.

Підрахунок клітин мікроорганізмів здійснюють з імерсійним об’єктивом 90−100х у квадратах окулярної сітки(не менше 10 полів зору), переміщуючи препарат по діагоналі.

Завдання на виконання

1.Аналіз посівів з лабораторної роботи №3 (пробірки, чашки Петрі,

завдання № 1–2). Приготувати препарати дріжджів, що виросли, розглянути у мікроскопі, замалювати.

2.Аналіз посівів з лабораторної роботи № 3 (чашки Петрі, завдання №

3).

2.1.Описати колонії мікроорганізмів. У процесі опису колоній зазвичай враховують такі морфологічні і культуральні ознаки:

–розмір колоній (їхній діаметр у мм);

–форма колоній (округла, неправильна, міцелеподібна, ризоїдна, амебоподібна, складчаста, концентрична, складна тощо);

–колір колоній (білий, жовтий, рожевий і т.д., здатність виділяти пігменти

усередовище);

–поверхня колоній (гладенька, складчаста, шорохувата, бугриста тощо);

45

–оптичні властивості (прозорі, напівпрозорі, непрозорі, блискучі, матові, з флуоресценцією тощо);

–профіль колоній (плоский, слабко опуклий, сильно опуклий, увігнутий, кратероподібний);

– край колоній (рівний, звивистий, зубчастий, неправильний, хвилеподібний, нитчастий, ворсинчастий, вієподібний, нерівний);

– консистенція колоній (масляниста, тістоподібна, в’язка, плівкова).

2.2.Приготувати препарати дріжджів «роздавлена крапля», розглянути у мікроскопі, замалювати.

2.3.Виявити запасні речовини(глікоген, поліфосфати, жироподібні речовини) у дріжджів.

Запасні речовини вуглеводної природи(у тому числі глікогенй )

дріжджів. Реакція на глікоген добре проходить лише у кислому середовищі, тому перед виявленням глікогену середовище, на якому вирощували дріжджі, підкислюють.

У дріжджів жироподібні речовини представлені нейтральними жирами, які легко виявляються у живих клітинах(без спеціальних методів фарбування) у вигляді крапель, що сильно заломлюють світло.

Поліфосфати (волютин, метахроматин). У клітинах еукаріот волютин локалізований у вакуолях. Фарбування волютинових гранул базується на явищі метахромазії – здатності спричиняти зміну кольору деяких барвників (метиленовий синій, толуїдиновий синій). Для виявлення волютину у дріжджів використовують такий спосіб. Фіксований у полум’ї спиртівки мазок фарбують метиленовим синім за Леффлером упродовж3 хв. Барвник зливають, препарат промивають водою і без висушування наносять на мазок краплину1 %-ного розчину сірчаної кислоти. Мазок накривають накривним скельцем і мікроскопують. Волютин має вигляд крапель синьо-фіолетового кольору на слабко голубому фоні цитоплазми.

3.Пересіяти ізольовані колонії з чашки Петрі(лабораторна робота № 3, завдання № 3) у пробірки із скошеним агаризованим середовищем (ГКА).

4.У культуральній рідині(посів на рідке поживне середовище– лабораторна робота №3, завдання № 2) визначити: кількість життєздатних клітин за методом Коха (посів на чашки з ГКА або СА).

Контрольні запитання

1.Які методи кількісного обліку мікроорганізмів Ви знаєте?

2.У чому полягає суть методу Коха?

3.Яких умов необхідно дотримуватися для забезпечення точності методу

Коха?

46