
- •ЗАГАЛЬНА МІКРОБІОЛОГІЯ І ВІРУСОЛОГІЯ
- •КИЇВ НУХТ 2010
- •Лабораторна робота № 3
- •Лабораторна робота № 4
- •Лабораторна робота № 5
- •Таблиця 5.1
- •Кількісний облік мікроорганізмів
- •Лабораторна робота № 6
- •Лабораторна робота № 7
- •Лабораторна робота № 9
- •Лабораторна робота № 11
- •Лабораторна робота № 15
- •Нітрифікуючі бактерії
- •Nitrosomonas europaea
- •Nitrobacter winogradskyi
- •Nitrobacter winogradskyi
- •Характеристика накопичувальних культур мікроорганізмів
- •ЛІТЕРАТУРА
- •ЗАГАЛЬНА МІКРОБІОЛОГІЯ І ВІРУСОЛОГІЯ
- •ЛАБОРАТОРНИЙ ПРАКТИКУМ
молібден, залізо та сірка, і білка, який містить залізо та сірку. Як сам фермент, так і процес азотфіксації є дуже чутливими до молекулярного кисню. Для фіксації азоту необхідні енергія та відновлювальні еквіваленти, які можуть бути одержані в процесі фотосинтезу, дихання чи бродіння.
У багатьох бактерій нітрогеназа утворюється тільки , тодіколи вона необхідна, тобто за відсутності джерела зв’язаного . азІотуни амонію пригнічують синтез нітрогенази.
Перетворення аміаку (амонію) на нітрат – нітрифікація – здійснюється нітрифікуючими бактеріями. Проте немає таких бактерій, які б перетворювали аміак безпосередньо в нітрат. В його окисненні завжди беруть участь дві групи бактерій: одні окиснюють аміак, утворюючи нітрит, інші окиснюють нітрит у нітрат.
|
|
|
Нітрифікуючі бактерії |
|
|
|
|
||
Бактерії, які окиснюють |
|
Бактерії, які окиснюють |
|
|
|||||
аміак (Nitroso-) |
|
нітрит (Nitro-) |
|
|
|
||||
NH4+ + 1 ½ O2 ® NO2- + 2 H+ + H2O |
|
NO2- + ½ O2 ® NO3- |
|
|
|||||
Nitrosomonas europaea |
|
Nitrobacter winogradskyi |
|
|
|||||
Nitrosococcus oceanus |
|
Nitrobacter agilis |
|
|
|
||||
Nitrosospira briensis |
|
Nitrospira gracilis |
|
|
|
||||
Nitrosolobus multiformis |
|
Nitrococcus mobilis |
|
|
|
||||
Нітрифікатори |
|
– |
грамнегативні |
бактерії, які |
належать |
до |
родини |
||
Nitrobacteriaceae. |
До |
|
останнього |
|
часу |
їх |
вважали |
обліга |
|
хемолітоавтотрофами, оскільки вони не використовують органічні субстрати, |
|
||||||||
які були добавлені в поживні середовища. Проте нині існує багато сумнівів |
|
||||||||
щодо облігатності нітрифікаторів. Так, виявилося, що Nitrobacter winogradskyi |
|
||||||||
здатний використовувати ацетат для синтезу деяких клітинних речовин(білків, |
|
||||||||
полі-b-оксибутирату). |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Роль процесів нітрифікації в грунті. У грунті, який інтенсивно аерується, |
|
||||||||
іони амонію, що вивільнюються в результаті мінералізації азотвмісних речовин, |
|
||||||||
швидко окиснюються. Перехід катіону (NH4 |
+ ) в аніон (NO3ˉ) супроводжується |
|
|||||||
підкисленням грунту |
і |
підвищенням |
|
розчинності |
мінералів(солей |
калію, |
|
кальцію, магнію та фосфорної кислоти). Тому в нітрифікаторах убачають важливий фактор підвищення родючості грунтів. Але нині ця думка змінилася. Виявилося, що іони амонію затримуються в грунті значно довше і краще нітрату, який легко вимивається. У зв’язку з цим з’явилася тенденція до обмеження нітрифікації в грунтах сільськогосподарських угідь. Вишукуються речовини, які здатні специфічно пригнічувати ріст нітрифікуючих бактерій і стати “стабілізаторами” грунтового азоту.
Слід враховувати, що ріст і метаболізм автотрофних нітрифікаторів проходить нормально лише за рН 7–8. Діапазон рН, в якому відбувається повна нітрифікація від аміаку до нітрату, є дуже вузьким, оскільки і аміак (за високих значень рН), і азотна кислота (за низьких значень рН) спричиняють токсичний вплив на Nitrobacter.
115
Нітрифікуючі бактерії опосередковано беруть участь у руйнуванні різних споруд, для яких будівельним матеріалом є вапно та цемент. Це пов’язано з тим, що нітрифікатори окиснюють аміак, який є в атмосфері та екскрементах тварин, до азотної кислоти.
Кругообіг фосфору. У біосфері фосфор представлений майже винятково у вигляді фосфатів. У живих організмів фосфорна кислота існує у формі ефірів. Після відмирання клітин ці ефіри швидко розкладаються, що супроводжується
вивільненням іонів фосфорної |
кислоти. Для рослин доступною |
формою |
фосфору в грунтах є вільні |
іони ортофосфорної кислоти(Н3РО4). |
Їх |
концентрація часто буває низькою; ріст рослин, як правило, лімітується не |
||
загальною недостатністю фосфатів, а |
утворенням малорозчинних його сполук |
(апатити, комплекси з важкими металами). У багатьох місцях фосфат з добрив потрапляє у проточні водойми. Оскільки концентрація іонів заліза, кальцію та алюмінію в водоймах є невисокою, фосфат залишається у розчинній формі, що супроводжується евтрофізацією водойм, особливо сприятливою для розвитку
азотфіксувальних |
ціанобактерій. У |
грунтах |
же |
внаслідок |
утворення |
нерозчинних солей |
фосфати найчастіше швидко |
стають |
недоступними для |
||
рослин. |
|
|
|
|
|
Фосфор та азот як фактори, лімітувальні продукцію біомаси.
Елементами, що обмежують ріст рослин і тим самим продукцію біомаси як на суші, так і в океанах, є фосфор та азот. За даними табл. 15.1 можна розрахувати, скільки біомаси може бути синтезовано з елементів, які містяться в 1 м3 морської води. З 28 г вуглецю може утворитися 60 – 100 г біомаси, з 0,3 г азоту – 6, а з 0,03 г фосфору – лише 5 г. Отже, продукцію біомаси лімітують в основному фосфати. У морській воді навіть азотфіксувальні організми– ціанобактерії – не мають селективної переваги перед іншими.
|
Розподіл біоелементів у морській воді |
Таблиця 15.1 |
|||
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
Елемент |
Вміст у сухій речовині |
Вміст у морській |
|
Відношення |
|
|
організмів (N), |
воді (А), |
|
А/N |
|
|
г / 100 г |
г/м3 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Калій |
1 |
390 |
|
390 |
|
Вуглець |
30 |
28 |
|
~1 |
|
Кремній |
0,5 |
0,5 |
|
1 |
|
Азот |
5, |
0,3 |
|
0,06 |
|
Фосфор |
0,6 |
0,03 |
|
0,05 |
|
Сірка |
1 |
900 |
|
900 |
|
Залізо |
1 |
0,05 |
|
0,05 |
|
Ванадій |
0,003 |
0,0003 |
|
0,1 |
|
|
|
|
|
|
|
116
Завдання на виконання
1. Розглянути чашки з середовищем Гетчинсона(лабораторна робота №14). Навкруги зразків грунту на чашці розвиваються колонії
целюлозоруйнівних мікроорганізмів у вигляді жовтих, зелених, оранжевих та |
|
|||||||||
коричневих |
плям. У |
місцях |
утворення |
колоній |
|
фільтрувальний |
папір |
|||
розкладається, |
ослизнюється, |
стає |
прозорим. За |
морфологією |
можна |
|||||
диференціювати колонії мікроміцетів, бактерій та актиноміцетів. Описати |
|
|||||||||
морфологію колоній. |
|
|
|
|
|
|
|
|
||
2. Зі зразків грунту одержати накопичувальну культуру денітрифікуючих |
|
|||||||||
бактерій. |
Для |
цього |
використовують |
синтетичне |
середовище |
Гільтая |
||||
(лабораторна |
робота |
№14). У пробірки з середовищем Гільтая вносять |
||||||||
шматочок грунту, заливають шаром вазелінової олії (5 мм), щільно закривають |
|
|||||||||
резиновими корками і вирощують упродовж 7−10 діб при 30−35 °С. |
|
|
3. Зі зразків грунту одержати накопичувальну культуруанаеробних амоніфікаторів. Для виявлення анаеробних амоніфікаторів використовують м’ясний бульйон з добавленням 2 % пептону. Середовище наливають високим шаром у великі пробірки, щільно закривають пробками і стерилізують. Пробірки з середовищем засівають шматочком грунту, під пробку підвішуюють смужку червоного лакмусового паперу(для виявлення аміаку) і смужку фільтрувального паперу, змоченого 10 %-ним розчином оцтовокислого свинцю (для виявлення сірководню). Пробірки інкубують при 25−28 °С упродовж 3−5 діб.
4. |
Зі |
зразків |
грунту |
одержати |
накопичувальну |
ку |
||||
азотфіксувальних |
мікроорганізмів. |
Виявлення |
азотфіксувальних |
бактерій |
||||||
здійснюють на синтетичних середовищах, в яких відсутні джерела азотного |
||||||||||
живлення. (середовище |
Ешбі). Склад |
середовища |
Ешбі(г/л): маніт (або |
|
||||||
глюкоза, або сахароза) – 20; K2HPO4 – 0,2; MgSO4·7H2O – 0,2; NaCl – 0,2; K2SO4 |
|
|||||||||
– 0,1; CaCO3 – 5,0; рН |
середовища 6,0−6,5. Нестерильне середовище Ешбі |
|||||||||
розливають по 50 мл в колби об’ємом250 мл, вносять шматочок грунту (1/2 |
|
|||||||||
чайної |
ложки), закривають |
ватними |
пробками |
і вирощують на |
качалці |
при |
||||
28−30 °С упродовж 5−7 діб. |
|
|
|
|
|
|
|
Контрольні запитання
1.Охарактеризуйте виділені Вами мікроорганізми-деструктори целюлози.
2.Назвіть бактерії, які беруть участь у кругообігу азоту в природі.
3.Охарактеризуйте процес денітрифікації.
4.Яка роль процесів денітрифікації у природі?
5.У чому полягає суть процесу нітрифікації? Які бактерії беруть участь у нітрифікації?
6.Яка роль процесів нітрифікації у природі?
7.Охарактеризуйте азотфіксувальні бактерії.
8.Як відбувається кругообіг фосфору у природі?
117
9. |
Як |
здійснюється |
виділення |
накопичувальної |
куль |
денітрифікуючих бактерій? |
|
|
|
||
10. Як здійснюється виділення накопичувальної культури амоніфікаторів? |
|
||||
11. |
Як |
здійснюється |
виділення |
накопичувальної |
культ |
азотфіксувальних бактерій?
Лабораторна робота № 16
УЧАСТЬ МІКРООРГАНІЗМІВ У ПЕРЕТВОРЕННІ РЕЧОВИН ТА ЕНЕРГІЇ У ПРИРОДІ (підсумкове заняття) ( 4 год.)
Мета роботи: проаналізувати результати роботи з одержання накопичувальних культур денітрифікаторів, амоніфікаторів та азотфіксаторів, охарактеризувати властивості одержаних накопичувальних куль (лабораторні роботи № 14–16).
Матеріали та обладнання: реактив Несслера, розчин Люголя, мікроскоп, предметні та накривні скельця, спиртівки, бактеріологічні петлі, піпетки.
Завдання на виконання
1. Розглянути пробірки з середовищем Гільтая(лабораторна робота №15). Розвиток анаеробних денітрифікаторів супроводжується помутнінням
середовища, |
виділенням |
газів СО2 і N2. Нерідко за розвитку бактерій |
Pseudomonas |
aeruginosa |
спостерігається позеленіння рідини(утворюється |
зеленувато-синій пігмент). Описати характер росту денітрифікуючих бактерій. |
||
Протікання процесу |
денітрифікації можна контролювати за зникненням |
нітратів і нітритів з середовища за якісною реакцієюз дифеніламіном і за
появою |
аміаку у |
середовищі з |
реактивом Несслера. У фарфорову чашку |
вносять |
3−4 краплі |
концентрованої |
сірчаної кислоти, добавляють кристалик |
дифеніламіну, і після його розчинення −1 краплю досліджуваної рідини. За наявності азотної кислоти рідина забарвлюється у темно-синій .колірДля виявлення аміаку до кількох крапель середовища добавляють краплю реактива Несслера. За присутності слідових кількостей аміаку рідина набуває жовтого кольору, а за вищої концентрації – утворюється коричневий осад.
Провести якісну реакцію на аміак(з реактивом Несслера). Приготувати препарат “роздавлена крапля”, розглянути під мікроскопом, визначити морфологічні особливості бактерій. Замалювати.
2. Розглянути пробірки з амоніфікаторами(лабораторна робота № 15).
Описати якісну реакцію на присутність продуктів амоніфікації: амонію (посиніння лакмусового папірця) та сірководню (почорніння індикаторного
папірця). Приготувати |
препарат “роздавлена |
крапля”, розглянути |
під |
мікроскопом, визначити морфологічні особливості бактерій. Замалювати. |
|
118