МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ

ЗАГАЛЬНА МІКРОБІОЛОГІЯ І ВІРУСОЛОГІЯ

ЛАБОРАТОРНИЙ ПРАКТИКУМ

для студентів напряму 6.051401 “Біотехнологія” денної форми навчання

СХВАЛЕНО на засіданні кафедри

біотехнології мікробного синтезу Протокол №5

від 02.11.2009 р.

КИЇВ НУХТ 2010

Т.П. Пирог, М.М. Антонюк, С.В. Ігнатенко. – К.: НУХТ, 2010. — 1279 с.

Рецензент О.В. Карпов, д-р біол.наук

Укладачі: Т.П. Пирог, д-р біол. наук, проф.

М.М. Антонюк, канд. техн. наук

С.В. Ігнатенко

Відповідальний за випуск Т.П. Пирог, д-р біол. наук, проф.

Видання подається в авторській редакції

2

індивідуально. На робочому місці потрібно підтримувати зразковий порядок. Особисті речі повинні зберігатися в спеціально відведеному місці.

Під час виконання лабораторної роботи категорично забороняється

пластиром.

Працюючи з відкритим полум’ям (газовий пальник, спиртівка), потрібно дотримуватися таких вимог: запалювати спиртівку та газовий пальник лише за

3

перекриттям доступу газу. Розташовувати спиртівку потрібно на відстані не менш, ніж 20 см від краю робочого стола. Запалену спиртівку заборонено пересувати з місця на місце. По закінченню роботи з газовими пальниками необхідно перевірити, що вихід газу перекрито.

У разі випадкового займання ватно-марлевого корка необхідно терміново

слідкувати за наявністю запобіжних ватних тампонів у піпетках та - ватно марлевих корків у пробірках.

Роботу з культурами мікроміцетів можна проводити лише за наявності індивідуальних засобів захисту дихальних шляхів.

У разі випадкового потрапляння мікробного матеріалу на відкриті ділянки шкіри, стіл чи підлогу це місце треба ретельно обробити дезинфікувальним розчином.

слабким розчином соди, а луг – слабким розчином оцтової кислоти. Роботу з концентрованими та леткими хімічними речовинами необхідно проводити під витяжною шафою.

Необхідно суворо дотримуватисявимог електробезпеки. Забороняється використовувати несправне електрообладнання і вмикати прилади без дозволу викладача або лаборанта, а також торкатися поверхні приладу мокрими руками.

Після закінчення роботи студент повинен упорядкувати робоче місце, руки необхідно ретельно вимити, а за потреби обробити дезінфікувальним розчином. Слід мати індивідуальний рушник або серветки для витирання рук.

4

Лабораторна робота № 1

ОРГАНІЗАЦІЯ МІКРОБІОЛОГІЧНОЇ ЛАБОРАТОРІЇ. ПРАВИЛА РОБОТИ З КУЛЬТУРАМИ МІКРООРГАНІЗМІВ.

МОРФОЛОГІЧНІ ТА КУЛЬТУРАЛЬНІ ОЗНАКИ БАКТЕРІЙ (4 год)

Мета роботи: ознайомлення з організацією мікробіологічної лабораторії та правилами роботи у ній; закріплення знань про різні методи мікроскопії, будову бактеріальної клітини, методи вивчення морфології мікроорганізмів, закріплення практичних навичок з фарбування бактерій за Грамом, виявлення спор і капсул у бактерій, ознайомлення з характером росту актиноміцетів на агаризованих середовищах.

Матеріали та обладнання: спиртівки, бактеріологічні петлі, предметні та накривні скельця, генціанвіолет, водний фуксин, карболовий фуксин Ціля, метиленовий синій, розчин Люголя, 3 %-ний розчин КОН, 5 %-ний розчин сірчаної кислоти, етанол 96°, 10 %-ний розчин КОН (або NaOH), рідка чорна туш, гліцерин, фільтрувальний папір, промивалки з дистильованою водою,

мікроскопи, культури бактерій Escherichia coli, Sarcina flava, Bacillus subtilis var. mesentericus, Azotobacter chroococcum, Actinomyces (Streptomyces) aureofaciens.

Загальні відомості

Методи мікроскопії

Фазово-контрастна мікроскопія. Око людини виявляє тільки відмінності у довжині (кольорі) та амплітуді (інтенсивність, контрастність) світлової хвилі, але не уловлює відмінностей у фазі. Препарати живих клітин мікроорганізмів за забарвленням і прозорістю мало відрізняються від навколишнього середовища, оскільки світлові промені, проходячи через живу клітину, не змінюють своєї амплітуди, хоча й змінюються за фазою. Метод фазово-контрастної мікроскопії дає змогу перетворювати невидимі фазові зміни, яким піддається світлова хвиля під час проходження через мікробну клітину, у видимі амплітудні і тим самим підвищити контрастність зображення. Оптична система, використовувана для одержання фазового контрасту, складається з фазової пластини і кільцевої діафрагми (рис. 1.1).

Фазова пластина − це круг напилення з солей рідкісних металів на одну з лінз об’єктива. Вона забезпечує зміну фази прохідної хвилі на ¼, що приводить до перетворення фазових відмінностей у амплітудні. Кільцева діафрагма − це непроникна для світла пластина, що має прозору щілину у вигляді кільця, через яку світло потрапляє у конденсор. Фазовий ефект досягається лише за точного суміщення фазового кільця з проекцією кільцевої діафр. Фагмизовоконтрастне обладнання складається з набору фазових об’єктивів, які мають на

5

відповідає фазовій пластині певного об’єктиву, і допоміжного мікроскопа,

об’єктив, тому поле зору виглядає темним. Якщо препарат містить клітини мікроорганізмів, то косі промені під час проходження через такий препарат значною мірою відбиваються від поверхні клітин і настільки відхиляються від

конденсора. Темно-польовий конденсор має затемнену середню частину, тому центральні промені світла, що йдуть від дзеркала, затримуються, а у площину препарату потрапляють тільки бокові промені, відбиті від дзеркальної поверхні, розміщеної всередині конденсора (рис. 1.2).

Рис. 1.1. Схема проходження променів у фазово-

контрастному обладнанні:

1 – кільцева діафрагма; 2 – конденсор; 3 – об’єкт; 4 – об’єктив; 5 – фазова пластина

6

За мікроскопування у темному полі можна побачити об’єкти, величина яких вимірюється сотими долями мікрометра, лежить поза межами видимості

звичайного мікроскопа. Проте спостерігання об’єктів у темному полі дає можливість розрізнити тільки їх контури, але не дає можливості розглянути

Рис. 1.2. Схема проходження променів

конденсорі темного поля:

1 – лінза конденсора; 2 – чорна пластина; 3 – об’єктив

λ=460 нм) або ультрафіолетовими променями (λ=360−380 нм). В обох випадках виникає люмінесценція у кольоровій гаммі видимого спектра, тобто утворюється кольорове зображення об’єкта. Більшості мікробних клітин притаманна досить слабка власна або первинна люмінесценція, тому їх обробляють водними розчинами спеціальних барвників − флуорохромів, до яких належать акридин оранжевий, примулін, берберин та ін. Вони можуть забарвлювати не тільки всю мікробну клітину, а й вибірково концентруватися на певних клітинних структурах, спричиняючи їхнє світіння. Так, наприклад,

7

вивчення об’єктів і структур, що перебувають за межами видимості звичайних мікроскопів. Розподільча здатність електронних мікроскопів становить1−40 Å, збільшення у середньому105 раз. Будова електронного мікроскопа загалом аналогічна будові світлооптичного; окремі вузли електронного мікроскопа подібні до вузлів світлооптичного, перевернутого окуляром донизу, проте роль світлових променів в електронному мікроскопі відіграє пучок електронів, випромінюваних спеціальним джерелом − електронною гарматою (рис. 1.3).

Рис. 1.3. Схема дії електронного мікроскопа:

1 – електронна гармата; 2 – конденсорна лінза; 3 – об’єкт; 4 – об’єктна лінза; 5 – проміжне зображення; 6 – проекційна лінза; 7 – зображення об’єкта на екрані

8

Електрони потрапляють у магнітну конденсорну лінзу. Використовувати скляні лінзи або дзеркала для фокусування електронів не можна, оскільки скло непроникне для електронів. В електронному мікроскопі роль лінз відіграє кругове магнітне поле, під дією якого електрони можуть відхилятися або центруватися. Функція конденсорної лінзи електронного мікроскопа аналогічна

аналогічна лінзі окуляра) дає кінцеве збільшення об’єкта на флуоресційному екрані − металевій пластинці, вкритій тонким шаром сірчистого цинку або мінерала вілеміту. За потрапляння на екран електронних променів кожна частинка цього шару починає світитися; за заміщення екрану фотографічною пластинкою зображення об’єкта можна фотографувати.

Препарати для електронно-мікроскопічних досліджень поміщають на спеціальні сітки, на які нанесена надзвичайно тонка целюлозна або пластмасова плівка (підкладка); загальна товщина препарату і підкладки не повинна перевищувати 2500 Å. Для збільшення контрастності об’єкта проводять його напилення важкими металами (хромом, золотом, паладієм) у вигляді пари або здійснюють обробку контрастними речовинами(фосфорно-вольфрамова кислота, уранілацетат). У процесі дослідження морфологічних особливостей клітин мікроорганізмів у електронному мікроскопі вивчають цілі клітини; ультраструктуру клітин вивчають на їхніх зрізах, товщина яких не перевищує 800−900 Å. За допомогою електронного мікроскопа не можна спостерігати живі клітини мікроорганізмів, так як вони гинуть під час проходження пучка електронів через препарат. Електронні мікроскопи мають досить складну конструкцію і не використовуються у навчальних лабораторіях.

Морфологія бактерій

Ці організми за формою поділяються на кілька: сферичнігуп, циліндричні, спіральні, незвичної форми та нитчасті.

Сферичні бактерії, або коки (від грец. kokkos – зерно) мають округлу

діляться в одній площині і після поділу розміщуються попарно, наприклад,

Methylococcus capsulatus – бактерія, що окиснює метан; Neisseria gonorrhoeae –

збудник гонореї.

Стрептококи (Streptococcus) (від грец. streptos – ланцюжок) – коки, що діляться в одній площині. Після поділу між клітинами зберігається зв’язок, і вони розміщуються у вигляді ланцюжків, наприклад, Streptococcus lactis –

9

молочнокисла бактерія, що спричиняє скисання молока. Ланцюжки можуть бути короткими – 3–4 клітини або довгими (кілька десятків клітин).

Тетракоки (Tetracoccus) (від грец. tetra – чотири) – коки, що діляться в двох взаємно перпендикулярних площинах і після поділу утворюють тетради.

Наприклад, Aerococcus.

Сарцини (Sarcina) (від грец. sarcio – з’єдную) – коки, що діляться в трьох взаємно перпендикулярних площинах і після поділу розміщуються у вигляді пакетів з 8, 16, 32, 64 клітин. Наприклад, Sarcina flava – жовта сарцина; Methanosarcina methanica – метаноутворювальна сарцина.

Стафілококи (Staphylococcus) (від грец. staphyle – виноградне гроно) – коки, що діляться в кількох площинах і після поділу розміщуються у вигляді виноградного грона. Наприклад, Staphylococcus aureus – золотистий стафілокок, збудник гнійних інфекцій.

Коки не завжди бувають правильної круглої форми, вони можуть бути ланцетоподібними (Streptococcus pneumoniae – збудник пневмонії), овальними

(Peptostreptococcus), подовженими (Ruminococcus).

Більшість коків є нерухливими і не утворюють ендоспор, хоча деякі

Циліндрична форма бактерій (від грец. bacteria, лат. bacillum – паличка)

є характерною для більшості бактерій. Паличкоподібні бактерії поділяються на такі, що утворюють ендоспори(Bacillus, Clostridium), і на такі, що не утворюють ендоспор (Pseudomonas, Xanthomonas). Паличкоподібні форми бактерій розрізняються за довжиною, поперечним діаметром, формою кінців клітин і характером їх розміщення. Розрізняють палички довгі (понад 3 мкм) (Bacillus megaterium – гнильна бактерія; Clostridium botulinum – збудник ботулізму), короткі (1 мкм) (бактерії кишкової групи), дуже короткі (менше 1 мкм), довжина яких не набагато перевищує діаметр клітини, тому їх називають кокобактеріями (Brucella abortus – збудник бруцельозу). За поперечним діаметром бактерії поділяються на тонкі(Mycobacterium tuberculosis – збудник туберкульозу) і товсті (Escherichia coli – кишкова паличка). Кінці паличок можуть бути закруглені, з обрізаними краями, загострені, потовщені. Розміщуються палички поодиноко, по дві клітини (Pseudomonas), ланцюжками (Bacillus mycoides – типова грунтова бактерія). Деякі палички розміщені під кутом одна до одної, утворюючи фігури, подібні до X чи Y, наприклад артробактерії, корінебактерії, нокардії, мікобактерії.

Бактерії спіральної формирозрізняються за кількістю і характером завитків, довжиною та товщиною клітин. Їх можна поділити на форми, що не гнуться (вібріони, спірили), і на такі, що вигинаються (спірохети).

Вібріони (від лат. vibrare – коливатися, тремтіти) мають вигляд зігнутої палички чи коми (Vibrio cholerae – збудник холери).

Спірили (від лат. spiro – вигин) – спірально вигнуті клітини, що мають великий поперечний діаметр і невелику кількість високих завитків(Spirillum volutans – сапрофітна бактерія; Spirillum minus – патогенна, здатна спричиняти захворювання спірила).

10

рис. 1.4. Форма плоских квадратних пластинок і коробочкоподібних плоских клітин геометрично різноманітної форми є характерною для архебактерій.

Нитчасті форми бактерій (трихомні, від грец. trichoma – волосина) – це здебільшого паличкоподібні клітини, з’єднані в довгі ланцюжки, які об’єднані

яких характерним є поліморфізм. Це мікоплазми, L-форми, клітини яких не мають клітинної стінки, а також артро-, нокардіота корінебактерії, в яких у циклі розвитку спостерігається зміна форми клітини – кок – паличка – кок.

Розміри бактеріальних клітин сильно варіюють. Діаметр сферичних бактерій становить від 0,2 до 2,5 мкм. Найменшими є мікоплазми – 0,15 мкм. Цей розмір є теоретичною межею клітинного рівня організації життя, у якому в клітині ще може бути мінімум молекул білка(близько 1200) і мінімум ферментних реакцій, необхідних для підтримання клітинноїструктури. Паличкоподібні бактерії мають товщину 0,5 – 1,0 мкм, довжину від 1 – 2 до 10 мкм. Нитчасті форми можуть досягати макроскопічних розмірів(1 мм) і їх можна побачити неозброєним оком. Довжина спірохет коливається від 1 – 3 до 100 – 500 мкм. Нижній розмір одноклітинних бактерій визначається простором,

Г.Х.Грамом. У мікробіології забарвлення за Грамом є важливою таксономічною ознакою, з якою корелюють інші властивості бактерій. Суть методу полягає в тому, що при фарбуванні бактерій генціанвіолетом(кристалвіолетом, метилвіолетом) фарба з йодом утворює сполуку, що утримується клітинами при обробці їх спиртом. Такі бактерії забарвлені в синьо-фіолетовий колір і їх називають грампозитивними.

прокаріот. Специфічний гетерополімер пептидоглікан складається із:

11

− залишків N-ацетилглюкозаміну та N-ацетилмурамової кислоти, з’єднаних між собою b-1,4-глікозидними зв’язками;

− діамінокислот, з яких найчастіше зустрічаються мезо-діамінопімелінова

ліпідів і білків невисокий. У білках клітинних стінок грампозитивних бактерій набір амінокислот менший (4–12), ніж у грамнегативних (містяться практично всі амінокислоти, з яких складаються білки).

фосфатними місточками. У молекулі тейхоєвої кислоти поліол може містити моносахариди як замісники. Деякі з тейхоєвих кислот містять еритритол чи маніт. Припускається, що тейхоєві кислоти зв’язані з муреїном через фосфат за типом аміду. У складі тейхоєвих кислот деяких грампозитивних бактерій

12

витримують кип’ятіння впродовж кількох годин. Трудомістка та дорога техніка

спороутворювальними бактеріями є представники родуDesulfotomaculum. Описано понад 10 родів бактерій, які утворюють ендоспори, наприклад,

Bacillus, Clostridium, Desulfotomaculum, Sporolactobacillus, Oscillospora та ін.

Більшість із цих бактерій є рухомими завдяки перитрихально розміщеним джгутикам. Бактерії, які належать до родуBacillus, є строгими аеробами або факультативними анаеробами. Роди Clostridium і Desulfotomaculum об’єднують анаеробні бактерії, здатні до утворення спор. Клостридії одержують енергію за рахунок бродіння, види Desulfotomaculum − шляхом анаеробного дихання. Sporolactobacillus належить до молочнокислих бактерій. Sporosarcina має сферичні клітини, але за своїми фізіологічними ознаками належить до бацил.

Характерною особливістю спороутворювальних бактерій є низький вміст ГЦ (гуанін + цитозин) у ДНК клітин. Так, у клостридій ДНК містить від 22 до

27 % ГЦ.

Спори утворюються всередині бактеріальної клітини. Цей процес починається з накопичення білкового матеріалу, тому показник заломлення світла у місці утворення спори збільшується. При цьому відбувається споживання запасних речовин(полі-b-гідроксимасляної кислоти у аеробів та полісахаридів у анаеробів). Упродовж перших 5 год спороутворення значна частина білків материнської клітини розкладається. При цьому утворюється специфічна для спор речовина– дипіколінова кислота, яка не зустрічається у

сприятливих умов бактерії можуть необмежений час розмножуватися діленням як вегетативні клітини. Утворення спор починається лише тоді, коли не

вистачає поживних речовин або коли в надлишку накопичуються продукти обміну. Зрілі спори не проявляють ніякої метаболічної активності. Вони надзвичайно стійкі до дії високих температур, різного роду опромінень, хімічних агентів. Терморезистентність обумовлена низьким вмістом води – 15 % (стільки ж, скільки в сухому казеїні або у вовні). Терморезистентність спор приблизно пропорційна вмісту в них дипіколінової кислоти. Бактерії у вигляді спор можуть тривалий час перебувати у стані анабіозу. Так, у зразках грунту, які зберігались 50−100 років, були виявлені спори бацил.

Капсула та слизовий шар. Капсула розміщена поверх клітинної стінки. Розрізняють мікрокапсули, завтовшки 0,2 мкм. Їх не можна побачити за допомогою світлового мікроскопа, а тільки виявити імунологічно(за набуханням при змішуванні із специфічними антитілами). Макрокапсули – завтовшки понад 0,2 мкм, добре видимі у світловому мікроскопі. Слизовий шар

– за товщиною у багато разів перевищує розміри клітини. Являє собою гідратовану в’язку масу, що накопичується на поверхні клітини.

13

За хімічним складом капсули поділяються на1) капсули полісахаридної природи, які складаються з: а) гомополісахаридів (побудовані з одного і того ж моносахариду, наприклад, у Leuconostoc mesenteroides – з глюкози, у бактерій роду Klebsiella – з галактози); б) гетерополісахаридів (побудовані з різних моносахаридних залишків, наприклад, у Pseudomonas aeruginosa – із залишків глюкози, галактози, манози, рамнози, глюкуронової кислоти); 2) капсули, які складаються з поліпептидів і полісахаридів, наприклад, у Bacillus megaterium.

Актиноміцети. Актиноміцети – це грампозитивні бактерії, які утворюють розгалужені нитки або гіфи у вигляді міцелію, тобто утворюють подібність міцелію (повітряного та субстратного). Міцелій може бути стабільним або розпадатися на паличкоподібні та кокоподібні елементи. Якщо міцелій зберігається, то утворюються спори, за допомогою яких відбувається розмноження. Спори можуть утворюватись безпосередньо на повітряних гіфах (спорофорах), від яких відшнуровуються конідії, або в спорангіях. Деякі

тонкими прокаріотними гіфами, які містять багато нуклеоїдів і не завжди

стрептоміцети асимілюють целюлозу, хітин та інші природні речовини, що важко розкладаються. Міцелій поділяється на субстратний і повітряний, який служить для розмноження. Конідієспори є одночасно і органами розмноження, і формами спокою. Стрептоміцети є продуцентами антибіотиків(стрептоміцин, хлороміцетин, ауреоміцин, тетрацикліни).

14

нанесенням спирту на мазок). Від тривалості обробки мазка спиртом залежить

1−2 хв водним фуксином. Зливають барвник, препарат промивають водою, висушують фільтрувальним папером. Мікроскопують препарат з імерсійною системою. Грампозитивні бактерії забарвлюються у синьо-фіолетовий колір, грамнегативні − у червоний або рожевий колір фуксину(колір додаткового барвника).

2. Паралельно провести визначення грам-типу вказаних бактерій за допомогою експрес-методу (обробка 3 %-ним КОН). Цей експрес-метод базується на руйнуванні клітин грамнегативних бактерій у лужному середовищі і визначенні вільної ДНК. На предметне скло наносять краплю3 %-ного

висушують на повітрі. Для фіксації і розрихлення оболонок ендоспор мазок не менше 10 раз проводять над полум’ям спиртівки. На препарат кладуть клаптик фільтрувального паперу, добре змочують карболовим фуксином , Ціля підігрівають упродовж 3−5 хв до появи пари(але не до кипіння). При цьому треба пильно слідкувати, щоб фарба не випаровувалася, а папір не підсихав, тому періодично добавляють нові порції фарби. Після охолодження знімають папір і упродовж 6−10 с препарат знебарвлюють 5 %-ним розчином сірчаної кислоти, відразу ж промивають водою(спори залишаються забарвленими у

водою, висушують і мікроскопують з імерсією. У разі правильного фарбування спори забарвлюються у яскраво-червоний колір і чітко виділяються на синьому фоні цитоплазми.

4. Виявити капсули у Azotobacter chroococcum за методом Омелянського. Розглянути під мікроскопом, замалювати.

Для виявлення капсул на предметне скло наносять краплю карболового фуксину Ціля і краплю води. Поміщають у краплю барвника досліджувану культуру бактерій і витримують упродовж2−3 хв. Добавляють краплю рідкої чорної туші або 10 %-ного водного розчину нітрозину і ретельно перемішують. Накривають накривним скельцем і розглядають з об’єктивом40х або розмазують по склу, висушують на повітрі і мікроскопують з імерсією.

15

Барвники не проникають у капсулу, тому безбарвна капсула добре видна на загальному темному фоні препарату і забарвлених у червоний колір клітин бактерій.

5.Ознайомитись з характером росту актиноміцетівActinomyces

(Streptomyces) aureofaciens на агаризованих середовищах. Приготувати препарат «відбиток» Actinomyces (Streptomyces) aureofaciens, розглянути та замалювати.

Культури стрептоміцетів, вирощені на середовищі в чашках Петрі, можна

видно, що гіфи частково проникли у субстрат, частково стеляться по поверхні і піднімаються над нею. Можна побачити спорофори зі спорами. З цих же культур можна приготувати препарати для мікроскопічного вивче: наня предметне скло наносять краплю 10 %-ного розчину лугу (КОН або NaOH) або 70−90 %-ного розчину оцтової кислоти або 60° етанолу, в якій розщеплюють за допомогою двох препарувальних голок міцелій, взятий з невеликим шматочком середовища. Препарат щільно накривають накривним скельцем мікроскопують із збільшенням 40х. На такому препараті добре видно різницю у товщині субстратних і повітряних гіфів, форму спороносіїв.

Для вивчення типу спороутворення, форми та розміру спор готують препарат «відбиток». Для приготування такого препарату накривне скло щільно притиснюють до поверхні колонії, потім поміщають його на предметне скло у краплину води відбитком донизу і мікроскопують з об’єктивом 40х.

Контрольні запитання

1.Яких правил техніки безпеки необхідно дотримуватися під час роботи

умікробіологічній лабораторії?

2.У чому полягає суть фазово-контрастної мікроскопії?

3.Охарактеризуйте мікроскопію у темному полі.

4.Які особливості притаманні люмінесцентній мікроскопії?

5.У чому полягає суть електронної мікроскопії?

6.Які переваги і недоліки притаманні кожному з методів мікроскопії?

7.На які групи за морфологічними ознаками поділяються бактерії?

8.На основі яких ознак сферичні бактерії поділяються на кілька груп?

9.Що таке ендоспори?

10.Дайте характеристику спороутворювальних бактерій.

11.Як відбувається процес споруляції?

12.Що таке капсула? Як поділяються капсули за розміром і хімічною природою?

13.У чому полягає суть фарбування бактерій за Грамом?

14.Охарактеризуйте хімічний склад клітинних стінок бактерій.

15.Які відмінності виявлено у складі клітинної стінки грампозитивних і грамнегативних бактерій?

16.Що таке пептидоглікан?

16

17.Назвіть типові бактеріальні полісахариди.

18.Які функції виконує клітинна стінка і капсула?

19.Які характерні ознаки притаманні актиноміцетам?

20.На основі яких ознак актиноміцети належать до бактерій?

21.За якими методами можна виявити спори і капсули у бактерій?

22.Як здійснюється забарвлення за Грамом?

Лабораторна робота № 2

СКАНУЮЧА ЗОНДОВА МІКРОСКОПІЯ. МОРФОЛОГІЧНІ ТА КУЛЬТУРАЛЬНІ ОЗНАКИ ГРИБІВ І ДРІЖДЖІВ (4 год)

Мета роботи: ознайомлення з методом скануючої зондової мікроскопії, закріплення знань про будову дріжджової і грибної клітини, методи вивчення морфології мікроорганізмів, закріплення практичних навичок з приготування препаратів «роздавлена крапля» і препаратів для вивчення грибів.

cerevisiae, Saccharomycoides ludwigii, Shizosaccharomyces pombe, Candida scottii, Rhodotorula glutinis, Trichosporon cutaneum, культури грибів Rhizopus nigricans, Aspergillus niger, Fusarium culmorum, Trichotecium roseum.

Загальні відомості

Скануюча зондова мікроскопія: методи та апаратура, побудова та обробка зображень. Скануюча зондова мікроскопія(СЗМ) – найсучасніший метод дослідження структури і властивостей поверхні різних об’єктів з наглядним представленням інформації у трьохмірному вигляді. Роздільна здатність зображення об’єктів може досягати тисячних долей нанометрів, що дає змогу візуалізувати навіть атомну та молекулярну структуру поверхні,

17

окремі атоми в розчинах електролітів. Скануючий ємкісний мікроскоп (СЄМ)

низькочастотні звукові вимірювання з роздільною здатністю в 10 нм тощо. Прототипом всіх зондових мікроскопів нових конструкцій є скануючий

потенційного бар’єру, який утворений внаслідок розриву електричного ланцюга

– незначним проміжком між зондуючим мікровістрям і поверхнею зразка. В основі роботи приладу лежить відомий феномен електронного тунелювання: між металевим вістрям та поверхнею досліджуваного провідника прикладають

електричну напругу і вістря наближають до поверхні зразка до появ тунельного струму. Відстань від вістря до поверхні може становити долі нанометра. Підтримуючи постійну величину тунельного струму, переміщують металеве вістря над поверхнею зразка. При цьому траєкторія руху вістря співпадає з профілем поверхні.

В СТМ в якості зонда використовують заточене вістря, виготовлене із металевої проволоки (вольфрамова, із сплаву благородних металів). Для дослідження біологічних об’єктів застосовують зонди невеликого діаметру(1 –

18

того, що розсіювання світла відбувається у ближній зоні(на відстані до випромінюючої діафрагми меншому, ніж довжина хвилі) стають помітними

інформація представляється у вигляді двомірної матриці цілих чисел, кожне з яких (залежно від режиму сканування) може бути значенням тунельного струму чи значенням відхилення мікроманіпулятора, чи значенням якоїсь більш складної функції. Далі числа вихідної матриці перевтілюють у сприйнятливий

матриці відображається в точку певного кольору на прямокутному зображенні. Рядок і стовпчик, в яких знаходиться це значення, стають координатами точки. В результаті отримують картину, на якій, наприклад, висота поверхні передається кольором – як на географічній карті. Кількість кольорів при цьому

– сотні і тисячі.

Залежно від розміру об’єкта, що необхідно розглянути, використовують різні методи обробки зображень:

віднімання середнього нахилу – у разі наявності певного нахилу, що заважає виявленню структури об’єкта, із вихідної матриці значень віднімається площина середнього нахилу. У результаті одержують матрицю з меншим діапазоном значень і дрібні деталі відображаються більшою кількістю кольорів та стають більш помітними.

усереднення значень всіх точок матриці та навколишніх у випадку наявності високочастотного вихідного сигналу. Це дозволяє збільшити рівень розмірів навколишньої області, по якій проводиться усереднення.

медіанна фільтрація дозволяє відсортувати різки відхилення числових значень.

усереднення по рядках застосовують при появі дефектів зображення внаслідок швидкого зчитування інформації і зсуву числових рядків матриці вверх або вниз. Всі рядки зображення здвигаються вверх або вниз так, щоб їх значення були однаковими. При цьому профіль рядка залишається попереднім, а профіль стовпчика – змінюється за рахунок прибирання сходинок.

вищі гриби, які розмножуються переважно брунькуванням або поділом. Таке визначення є недостатньо точним, оскільки окремі видидріжджів здатні в певній фазі розвитку утворювати міцелій, а деякі мікроскопічні міцеліальні

19

гриби в певних умовах культивування ростуть у дріжджоподібній формі. Проте

лимоноподібну (Nadsonia), грушоподібну (Schizoblastoporium), стрілоподібну

(Brettanomyces), серпоподібну (Selenotila).

Для деяких дріжджів форма клітин настільки характерна, що може бути використана для встановлення їх родової належності(наприклад, у Trigonopsis клітини трикутні). У представників роду Candida, навпаки, морфологія клітин не постійна, вона змінюється залежно від складу середовища таумов культивування, тому не може використовуватись як таксономічна ознака. Розміри дріжджових клітин також варіюють у широких межах, мкм: діаметр найдрібніших клітин становить 1,5–2,0, довжина – 3–5, діаметр великих клітин

– 8–10, їх довжина – 11–18, довжина витягнутих клітин може досягати 20–25.

Способи розмноження дріжджів. Дріжджі розмножуються безстатевим (вегетативне розмноження і утворення безстатевих спор) і статевим способом (таблиця).

Розмноження мікроорганізмів (органи розмноження)

20

Морфологічна різноманітність аскоспор є таксономічною ознакою.

21

одноклітинні, нитчасті та міцеліальні форми. Мікроскопічні міцеліальні гриби називаються також мікроміцетами, пліснявими грибами.

Вегетативне тіло гриба (талом) складається з ниток затовшки близько 5 мкм – гіфів. Сукупність гіфів грибного талома називається м і ц е л і є м. Міцелій буває субстратним, коли гіфи вростають у поживне середовище, повітряним – гіфи піднімаються над субстратом. Гіфи можуть не мати поперечних перегородок (утворюють несептований міцелій) і можуть бути розділені такими перегородками (септами) на клітини (утворюють септований

міцелій). Однак у цьому разі цитоплазма однієї клітини сполучається з цитоплазмою сусідньої клітини через пору, яка міститься у центрі перегородки.

До нижчих грибів (фікоміцетів) належать гриби, вегетативні тіла яких (навіть за сильного розгалуження гіфів) не мають перегородок і тому є багатоядерними. Такий талом називаютьценоцитним. До нижчих грибів належать хітридіоміцети, ооміцети, зигоміцети. До вищих грибів (еуміцетів) належать аскоміцети, базидіоміцети, дейтероміцети. Для вищих грибів є характерними гіфи, розділені поперечними перегородками. Слід зазначити, що

у сучасній філогенетичній класифікації грибів(Hibbett et al., 2007) за результатами молекулярно-біологічних та генетичних досліджень ооміцети виведені з царства грибів, а дейтероміцети не існують як окремий таксон, вони розміщені серед аскота базидіоміцетних грибів.

грибів зустрічається у грунті. Вони беруть активну участь у біогеохімічному циклі перетворення вуглецю і належать як до зимогенної, так і автохтонної

22

Рис. 2.1. Морфологія мікроскопічних грибів:

I – дріжджі; II – аспергіл; III – пеніцил; IV – ризопус; а – клітина в стані спокою; б, в – клітина під час брунькування; г – аскоспори; д – утворення нової особини; 1 – ядро; 2 – вакуоль; 3 – бруньки; 4 – аскоспори; 5 – конідії; 6 – стеригми; 7 – конідіофор; 8 – метули; 9 – булавоподібне розширення конідієносця; 10 – вегетативна гіфа; 11 – спорангій; 12 – спорангіофор; 13 – столон; 14 – ризоїди.

найбільшу екологічну групу, що бере участь у мінералізації органічних речовин в екосистемах.

23

пластин, каналів, бульбашок і цистерн, оточених елементарною мембраною. Функції: забезпечення внутрішньоклітинного транспорту поживних речовин до місць проходження синтетичних реакцій, участь в обміні вуглеводів, синтезі ліпідів та інших важливих метаболічних процесах.

24

До мембранних систем клітини належитьапарат Гольджі – агреговані бульбашки або пластинки (діктиосоми) різних розмірів, які розміщуються біля

ферменти b-окиснення жирних кислот, гліоксилатного циклу, дегідрогенази та

вакуоль діє як резервуар для зберігання поживних речовин і гідролітичних

малопридатним для спостереження. Не можна допускати утворення бульбашок повітря під накривним склом; за надлишку води її видаляють фільтрувальним папером. Мікроскопування здійснюють з сухою системою.

2.Приготувати препарати “роздавлена крапля” дріжджів Candida scottii, Rhodotorula glutinis, Trichosporon cutaneum, розглянути під мікроскопом,

замалювати клітини, що брунькуються, псевдоміцелій, бластоспори.

3.Приготувати на предметному склі препарати грибів Rhizopus nigricans, Aspergillus niger, Fusarium culmorum, Trichotecium roseum. Розглянути під мікроскопом, замалювати міцелій, спорангієносці, конідієносці та конідії.

26

Вивчення морфологічних особливостей міцеліальних грибів можна здійснювати безпосередньо на чашках Петрі за малого збільшення(10х). Для приготування препаратів грибів за допомогою препарувальної голки вирізають шматочок міцелію (0,5 мм2) і обережно поміщають його у краплю води на предметне скло. Зверху на міцелій кладуть накривне скельце. Якщо вода не повністю оточує досліджуваний міцелій, слід добавити її з крапельниці під накривне скельце до повного занурення міцелію. Надлишок води видаляється фільтрувальним папером.

За малого збільшення можна побачити конідієносці. Їхню детальну будову вивчають з об’єктивом40х. Спорангії за такого способу зазвичай руйнуються і видно лише скупчення спор. Для виявлення незруйнованих спорангіїв слід обережно взяти препарувальною голкою невелику кількість міцелію і другою голкою зняти його на сухе предметне .склоРозглядаючи препарат без накривного скельця за малого збільшення можна побачити спорангієносці і круглі темні кульки на їхніх кінцях − спорангії.

Контрольні запитання

1.У чому полягає суть скануючої зондової мікроскопії?

2.Які дослідження дає змогу проводити метод скануючої зондової мікроскопії?

3.Що таке «дріжджі»? На основі яких ознак дріжджі належать до грибів?

4.Як поділяються дріжджі за морфологією і розмірами клітин?

5.Охарактеризуйте вегетативне розмноження дріжджів.

6.Як здійснюється безстатеве розмноження дріжджів?

7.Охарактеризуйте статеве розмноження дріжджів.

8.Які сполуки входять до складу клітинної стінки дріжджів?

9.Які функції виконує капсула дріжджових клітин?

10.Охарактеризуйте функції інших структурних компонентів дріжджової

клітини.

11.Що таке таллом?

12.На основі яких ознак гриби поділяються на вищі та нижчі?

13.Які вегетативні способи розмноження грибів Ви знаєте?

14.Охарактеризуйте безстатевий спосіб розмноження грибів.

15.У чому полягає суть статевого способу розмноження грибів?

16.Які функції виконують структурні компоненти грибної клітини?

17.Як готується препарат «роздавлена крапля» ?

18.Як можна здійснювати дослідження морфології грибів?

19.Як можна виявити конідіє- і спорангієносці у грибів?

27