Работа 5. Влияние рН на действие ферментов (2 часа)

Цель занятия - изучить влияние концентрации водородных ионов на ферментативную активность амилазы слюны.

Содержание работы. Провести гидролиз крахмала в присутст­вии слюны при различной кислотности среды. Сделать выводы о ско­рости ферментативной реакции при разном значении рН.

Подготовка к занятию. Необходимо знать, что такое рН и как кислотность среды влияет па диссоциацию и пространственную кон­фигурацию белковой молекулы, механизм действия ферментов, хи­мизм гидролиза крахмала.

Литература [4, с. 133-136, 139-144, 197-198, 252-253; 9, с. 154-182; 2, с. 299-324].

Вопросы для самоконтроля

1. Что такое фермент?

2. Какова химическая природа ферментов?

З.Как влияет кислотность среды на диссоциацию белков? 4.Почему концентрация водородные ионов в среде влияет на ак­тивность ферментов.

5. Как окрашиваются йодом декстрины?

6. Как приготовить буферный раствор?

Аппаратура и реактивы: водяная баня с термометром, штатив с пробирками, пипетки, раствор фосфата натрия однозамещенного, фосфата натрия двузамещенного, раствор крахмала, раствор йода в йодистом калии.

Ход работы

Пронумеровать шесть пробирок и приготовить в них фосфатные буферные смеси с различным значением рН по схеме:

Реактивы	№ пробирки
	1	2	3	4	5	6
№Н2Р04 (мл) №2НР04 (мл)	4,7 0,3	4,4 0,6	2,5 2,5	1,7 3,3	0,6 4,4	0,3 4,7
рН буферной смеси	5,6	6,0	6,8	7,0	7,8	8,1
Окраска растворов

В другие шесть пробирок палить по 5 мл крахмала, добавить по 1 мл фосфатной буферной смеси с различным значением рН. Затем в каждую пробирку добавить по 1 мл разведенной слюны (1:1), тща­тельно перемешать содержимое пробирок и поставить в водяную ба­ню при 38-40°С. Через 3-5 мин из пробирки № 3 взять несколько ка­пель раствора и провести реакцию с йодом на стекле. Повторить про­бу до тех пор, пока не произойдет полного расщепления крахмала (сохраняется желтая окраска йода).

После этого пробирки вынуть из бани и добавить в каждую по 1- 2 капли йода. Наблюдать появление различной окраски в соответст­вии с глубиной ферментативного гидролиза крахмала.

Записать результаты в таблицу и сделать выводы о значении рН среды, наиболее благоприятном для действия амилазы.

Контрольные вопросы

1. Объясните, почему амилаза слюны теряет свою активность при попадании в желудок?

2. Где преимущественно осуществляется гидролиз крахмала в ор­ганизме животного?

3. Приведите пример фермента, активного только в кислой среде.

Работа 6. Активирование и торможение действия фермента амилазы (2 часа)

Цель занятия - изучить влияние активаторов и ингибиторов на ферментативный гидролиз крахмала.

Содержание работы. Провести гидролиз крахмала со слюной в присутствии ионов К⁺, Na⁺, С1^-, Сu²⁺, в водном растворе, сделать вы­воды о глубине ферментативного гидролиза крахмала в присутствии ингибиторов и активаторов.

Подготовка к занятию. Необходимо знать механизм фермента­тивного гидролиза крахмала, роль активаторов ферментативных про­цессов, обратимые и необратимые ингибиторы ферментов, механиз­мы образования активных ферментов из проферментов.

Литература [2, с. 297; 315; 4, с. 133-145,197-198; 7, с. 165-175,262].

Вопросы для самоконтроля

1. Роль и природа ферментов.

2. Что собой представляют активаторы ферментов?

3. Механизм торможения ферментов.

4. Виды ингибирования.

5. Привести примеры активаторов ферментов.

6. Привести примеры ингибиторов ферментов.

Аппаратура и реактивы: водяная баня с термометром, штатив с пробирками, пипетки, 1%-ные водные растворы хлорида натрия, ка­лия, сульфата меди, ацетата меди, 1%-ный раствор крахмала, раствор йода в йодиде калия.

Ход работы

В четыре пробирки налить по 1 мл 1%-ного раствора NаСl, КСl, СuS0₄ и (СН₃СОО)₂Сu (каждый раствор в отдельную пробирку), в пя­тую пробирку - 1 мл дистиллированной воды. Добавить в каждую пробирку по 2 мл раствора крахмала и по 1 мл слюны. Перемешать содержимое пробирок и поместить их в водяную баню при 38-40°С. Через 2-3 мин из пробирки № 5 взять несколько капель на стекло и провести реакцию с йодом. При появлении фиолетово-красного ок­рашивания вынуть пробирки и поместить их в стакан со льдом.

Затем в каждую пробирку добавить по 1-2 капли йода и сравнить окраску растворов. Результат занести в таблицу и сделать выводы об активирующем и ингибирующем действии ионов на амилазу слюны.

Показатели	Содержимое пробирок
	1	2	3	4	5
	NаСl	КСl	CuSO4	(СНзСОО)2Сu	Н2О
Окраска
Продукты гидролиза.

Контрольные вопросы

1. Какие ионы являются активаторами амилазы слюны?

2. На основании чего сделан такой вывод?

3. Какие ионы служат ингибиторами амилазы?

4. Назовите активаторы и парализаторы, образуемые животным эрганизмом.

5. Значение ингибиторов для живых организмов.