Лабораторная работа № 6 определение массовой доли белка

Цель: овладение методами количественного определения массовой доли белка и проведение сравнительного анализа полученных данных.

Задание:

1. Определить содержание массовой доли белка в представленных образцах сырья и пищевых продуктов различными количественными методами.

2. Провести математическую обработку полученных данных.

3. Провести сравнительный анализ полученных данных, представленных в виде сводной таблицы.

4. Сделать заключение о проделанной работе.

Теоретические сведения

Среди азотистых веществ, входящих в состав пищевых про­дуктов, важнейшая роль принадлежит белкам. Их основное зна­чение заключается в незаменимости другими компонентами пи­щи. Белки составляют основу процессов жизнедеятельности орга­низма. Необходимость их постоянного обновления лежит в осно­ве обмена веществ.

Белки в организме выполняют структурную (построение тка­ней и клеточных компонентов) и функциональную (ферменты, гормоны, дыхательные пигменты и др.) роль.

Дефицит белка в пищевом рационе повышает восприимчи­вость организма к инфекционным заболеваниям, нарушает про­цессы кроветворения, обмен липидов, витаминов и др. У детей при белковой недостаточности замедляются рост и умственное развитие.

Длительный избыток белка в питании также отрицательно сказывается на жизнедеятельности организма, вызывая перевозбудимость нервной системы, нарушение обменных процессов, перегрузку печени и почек.

В ежедневном рационе взрослого человека белки должны составлять около 14% общей калорийности, сочетаясь в определенном соотношении с другими пищевыми веществами.

Известно, что растительные белки усваиваются организмом не полностью по сравнению с животными. Так, белки молока и яиц усваиваются на 96%, белки рыбы и мяса — на 95%, белки хлеба из муки пшеничной I и II сортов — на 85%, белки картофеля, хлеба из обойной муки, бобовых— на 70%. Учитывая, что растительные белки менее полноценны по составу незаменимых аминокислот, чем животные, потребление определенного количе­ства животных белков совершенно необходимо. Для взрослого человека доля животных белков в среднем должна составлять около 55% общего количества белка в рационе.

Массовую долю белка в пищевых продуктах определяют по количеству общего азота методом Кьельдаля. С развитием фото- и спектрофотометрии были разработаны методы количественного определения белка, основанные на его способности давать окрашенные соединения с .некоторыми реагентами. Среди них следует отметить метод Лоури, биуретовый метод. Находят применение также физико-химические методы, в основу которых 'положены специфические свойства белка: образование различной степени помутнения в зависимости от концентрации белка в растворе сульфосалициловой кислоты (нефелометрический метод), способность белка адсорбировать некоторые красители и другие свой­ства белка.

Все перечисленные методы могут быть отнесены к ускоренным. При относительно небольших затратах времени они характеризуются достаточно высокой точностью и простотой определения.

Порядок выполнения работы

Порядок определения массовой доли белка по методу Къельдаля (арбитражный) способом отгона и титрования

Сущность метода:

Предназначен для определения содержания белка в блюде или рационе с целью контроля его энергетической ценности. Сущность метода состоит в разрушении органического вещества навески концентрированной серной кислотой в присутствии катализаторов (сульфата меди (II) и сульфата калия). Выделившийся в результате реакции азот улавливается серной кислотой, и образуется сульфат аммония. При добавлении едкого натра выделяется аммиак, который отгоняют в раствор серной кислоты и оттитровывают. Для пересчета на содержание белка количество азота, содержащегося в навеске, умножают на соответствующий коэффициент. Коэффициенты пересчета выведены на основании процентного содержания азота в отдельных видах продуктов.

Проведение испытаний

Приготовление минерализата: Навеску в количестве 0,3-0,5гр. взвешивают с точностью до 0,0001гр., затем количественно переносят её в колбу Къельдаля, доливают 10 см³ концентрированной H²SO⁴ (ρ=1,84гр/см³) и в качестве катализатора добавляют катализатор, состоящий из смеси сульфата меди (II) и сульфата калия. Колбу Къельдадя закрывают воронкой и ставят на систему для минерализации (рис. 8).

Рисунок 8 - Установки для минерализации TURBOTHERM

1 - Нагревательный блок

2 - Панель управления

3 - Вставной штатив для реакционных сосудов

4 - Каплеулавливающий поддон

5 - Вытяжная система

6 - Двухъярусная стойка

7 – Колбы Къельдаля для минерализации

Нагревание продолжают до тех пор, пока жидкость в колбе не станет однородной. Внутренние стенки колбы должны быть чистыми, что достигается осторожным взбалтыванием содержимого колбы для смывания со стенок темных, обугленных частиц. По окончании сжигания содержимое колбы охлаждают.

Отгон. После минерализации количественно переносят минерализат в мерную колбу на 100см³, охлаждают, доводят содержимое колбы до метки дистиллированной безаммиачной водой. Отгон минерализата производят паром (до 150см³) на системе «Vopodest» (рис. 10). Для этого в реактор наливают 20см³ минерализата, в приемник - 30см³ 0,02н H₂SO₄, добавляют 2-3капли смешенного индикатора и запускают прибор. Окончание отгона можно проверить по реакции дистиллята по лакмусовой бумаге - реакция должна быть нейтральной.

Рисунок 10 - Установка для отгонки Vapodest-30

1 - Прижимное устройство для установки колбы или пробирки; 2 - Пробирка KTG/KMT, 250/100 мл или колба Къельдаля на 500/750 мл с широким горлом; 3 - Держатель для шланга входа водяного пара; 4 - Шланг входа водяного пара, тефлон; 5 - Конический уплотнитель; 6 - Зажим для стеклоизделий; 7 - Резьбовое соединение деталей Ø 18 мм с силиконовой прокладкой; 8 - Шланг ввода раствора NaOH, тефлон; 9 - Резьбовое соединение шланга ввода водяного пара с парогенератором; 10 - Каплеулавливающая насадка, стекло; 11 - Резьбовое соединение деталей Ø 32мм с силиконовой прокладкой; 12 - Холодильник для конденсации паров; 13 - Резьбовое соединение деталей Ø 14мм; 14 - Дисплей; 15 - Клавиатура, химически стойкий пластик; 16 - Сетевой выключатель; 17 - Клапан вентиляции; 18 - Шланг выхода дистиллята, 8/12 мм, силикон; 19 - Приемная емкость, обычно коническая колба; 20 - Основание для установки приемной емкости; 21 - Поддон для сбора пролитой жидкости

Титрование. Избыток кислоты оттитровывают 0,02н КОН до перехода окраски в грязно- зеленый цвет.

Контрольный опыт выполняют так же, как прописано выше, но без навески продукта. В качестве навески добавляют 10мл. воды.

Расчетная формула:

, где

V₁ – количество 0,02 КОН, пошедшее на титрование в контрольном опыте, см³;

V₂ – количество 0,02 КОН, пошедшее на титрование в рабочем опыте, см³;

К – поправочный коэффициент для 0,02н КОН;

В – эквивалентное количество искомого вещества (азота) в гр. или мг., которое эквивалентно реагирует с 1см³ титруемого раствора (0,02н КОН);

V₃ – объем колбы разведения, см³;

V₄ – объем вытяжки, взятое на отгон, см³;

m – масса навески, гр.;

100 – пересчет на 100 гр. продукта

Коэффициент В рассчитывается по формуле:

(мг/см³)

(гр/см³), где:

Е – грамм-эквивалент вещества (азота);

N – нормальность титруемого раствора (0,02н КОН)

Для определения содержания белка в блюде полученное количество азота в граммах умножают на соответствующий коэффициент. В среднем коэффициент пересчета азота на содержание белка в животных пищевых продуктах равен 6,25, в растительных продуктах - 5,5 – 6,0.

О принятом коэффициенте должно быть указано в рабочем журнале и в бланке результатов анализа.

Порядок определения массовой доли белка по методу Къельдаля фотометрическим способом

Сущность метода:

Метод основан на минерализации пробы по Къельдалю и фотометрическом измерении интенсивности окраски индофенолового синего, которая пропорциональна количеству аммиака в минерализате.

Проведение испытаний

Приготовление минерализата: Навеску в количестве 0,3-0,5гр. взвешивают с точностью до 0,0001гр., затем количественно переносят её в колбу Къельдаля, доливают 10 см³ концентрированной H₂SO₄ (ρ=1,84гр/см3) и в качестве катализатора добавляют 1,0см³ 33% пергидроля. Колбу Къельдаля закрывают воронкой и ставят на систему для минерализации (рисунок 2). Пергидроль добавляют на протяжении всего процесса минерализации. Минерализация считается законченной, если раствор в колбе Къельдаля перестает темнеть при добавлении пергидроля.

Приготовление пробы:

В мерную колбу на 50см³ вносят 2-4см³ минерализата, приливают ¾ объема колбы безаммиачной дистиллированной воды, затем 1см³ 50% раствора сегнетовой соли и 2см³ реактива Несслера, доливают безаммиачной дистиллированной водой до метки и через 15 минут фотоколориметрируют при длине волны 480-490нм.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов трех параллельных определений. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать 0,1% по содержанию азота.

Приготовление стандартной шкалы:

Шкалы готовят непосредственно перед колориметрированием в мерных колбах на 50см³. В колбы вносят 0,2,4,6,8,10,12,14см³ стандартного раствора хлористого аммония, приливают ¾ объема колбы безаммиачной дистиллированной воды, затем вносят 1см³ 50% раствора сегнетовой соли. Для предупреждения выпадения в осадок ионов кальция и магния, взбалтывают колбу. Далее вносят 2см³ реактивы Несслера, объем колбы доводят до метки безаммиачной дистиллированной водой и перемешивают. Окраска развивается в течение 15 минут. Через 30 мин. определяют оптическую плотность растворов на спектрофотометре при длине волны 480-490нм или фотоэлектроколориметре с синим светофильтром. Стабильность окраски растворов сохраняется в течение одного часа. Температура реактивов при проведении цветной реакции должна быть не ниже 20°C.

По полученным значениям строят график зависимости концентрации азота (С) от оптической плотности (Д)

Расчетная формула:

,

где:

С – концентрация азота, определенная по калибровочному графику и соответствующая оптической плотности, мг/см³;

V₁ – объем колбы разведения, см³;

V₂ – объем минерализата, взятого на колориметрирование, см³

m – навеска пробы, г

100 - пересчет на 100гр. продукта

Для определения содержания белка в блюде полученное количество азота в граммах умножают на соответствующий коэффициент. В среднем коэффициент пересчета азота на содержание белка в животных пищевых продуктах равен 6,25, в растительных продуктах - 5,5 – 6,0.

О принятом коэффициенте должно быть указано в рабочем журнале и в бланке результатов анализа.

Контрольные вопросы:

1. Каково значение белков для организма человека?

2. Каков принцип определения белка по методу Къельдаля?

3. В чем заключается способ определения белка по методу Къельдаля способом отгона и титрования?

4. В чем заключается способ определения белка по методу Къельдаля фотометрическим способом?

5. Каковы достоинства и недостатки способа определения белка по методу Къельдаля?