Получение и культивирование первичных культур клеток

Культивирование клеток в виде монослоя

Штаммы и линии клеток могут быть получены от различных фирм - поставщиков, или из коллекции клеточных культур.

Маточные культуры хранятся и транспортируются в жид­ком азоте и в твердой углекислоте, при температуре сухого льда. Поскольку клетки при температуре сухого льда обладают низ­кой жизнеспособностью, то сразу после их получения необхо­димо начать их культивирование или перезаморозить их в жид­ком азоте. В таком виде их можно хранить сколько угодно долго. Транспортировать клетки можно и в виде монослоя. Сосуды при этом должны быть просто закупорены.

Наряду со стационарными линиями клеток (НеLа,) в культи­вировании используются и первичные культуры клеток.

Первичными клеточными культурами называют клетки, по­лученные от животного, и которые поддерживаются в культуре до начала субкультивирования.

В качестве примера рассмотрим способ получения фибробла­стов кожи.

Выбрать участок кожи и обработать его стерилизующими агентами (70 % этанол). Вырезать стерильный участок 1 мм² и пе­ренести его в стерильную чашку Петри. Добавить в чашку Петри несколько капель полной ростовой среды (например, минималь­ная среда Дульбекко) с 10 % эмбриональной сывороткой теленка и разрезать стерильным скальпелем кусочек на 5-10 маленьких кусочков.

Инкубировать кусочки при 37 °С в течение ночи. После это­го осторожно, чтобы не сместить фрагменты, добавить в чашку 3 мл полной среды и продолжать инкубацию. Рост фибробластов из фрагментов кожи может происходить в течение недели.

Легко получают первичную культуру макрофагов мыши. Для этого стерилизуют кожу брюшной стенки 70 % этиловым спир­том. После этого удаляют кожу с брюшной стенки. Инъецируют в брюшную полость 2,5 мл ростовой среды с 10 % сывороткой телен­ка и 10-ю единицами гепарина. Затем массируют брюшную стенку для отделения макрофагов в суспензию.

Отсасывают брюшную жидкость стерильной иглой и пере­носят суспензию в стерильную чашку Петри, считают количество клеток и распределяют их по чашкам так, чтобы в чашке было 10^б клеток. В течение 30 мин макрофаги прикрепляются к чашке, а со­путствующие лимфоциты и фибробласты могут быть легко удале­ны сменой среды.

В настоящее время, кроме первичной культуры макрофагов получены и стационарные линии макрофагов.

Клетки способны прикрепляться к поверхности культурального сосуда и формировать монослой клеток. Такой тип культиви­рования называют монослоем. При достижении монослем границ культурального сосуда рост клеток может прекращаться. Это явле­ние получило название контактного торможения, так как при пол­ном заполнении поверхности дальнейший рост клеток тормозится.

Культивирование клеток в виде монослоя имеет ряд преиму­ществ перед суспензионным культивированием, т.е. культивирова­нием клеток в виде суспензии, которое обеспечивается непрерыв­ным перемешиванием суспензии клеток.

Культивирование клеток в монослое позволяет: легко менять культуральную среду, так как клетки прикреплены к поверхности; получать высокий уровень экспрессии клеточных продуктов, так как у клеток прикрепленных к субстрату эффективнее экспрессируются клеточные продукты; обеспечить максимальную гибкость исследо­ваний, поскольку может использоваться для любого типа клеток.

Наряду с этим, монослойная культура имеет и недостатки по сравнению с суспензионными культурами: возникают трудности при увеличении масштаба культивирования; требуют больших пространств; трудно определять динамику роста клеток; трудно обеспечивать гомогенность клеток.

Механизм прикрепления клеток к поверхности (стекло или пластик) может обеспечиваться электростатическими взаимодей­ствиями. Важным фактором в этом случае является суммарныйотрицательный заряд. Для увеличения эффекта взаимодействия, в частности органических поверхностей, проводят химическую обработку (окисляющими агентами, кислотами) или физические воздействия (электрический разряд, облучение ультрафиолетом, бомбардировка электронами высоких энергий).

Поверхность культурального сосуда может быть покрыта ве­ществом, которое облегчает прикрепление клеток. Чаще всего для этого используется коллаген и полиаминокислоты.

Клетки могут расти на мелких сферических носителях. В таком случае они могут рассматриваться как клеточные суспензии и для их выращивания могут применяться процессы и аппараты, разра­ботанные для суспензионных культур. Такое культивирование ис­пользуется в промышленности для получения вакцин и интерферо­на в ферментерах объемом до 1000 л. При этом культивировании используются первичные культуры клеток.

К сожалению, успешное выращивание клеток человека получается только в ферментерах лабораторного типа (объем реакторов до 20 л).

Хотя большое количество клеток животных вообще не выжи­вают в суспензионных культурах, для сохранения жизнеспособ­ности им необходимо образование межклеточных контактов (на­пример, культуры клеток человека WJ-88, МRС-5), суспензионные культуры более технологичны и их используют для наращивания клеточной массы.