Газовый состав ростовых сред

Наличие кислорода в среде культивирования является одним из факторов, обеспечивающих рост культуры. При культивирова­нии клеток в малых объемах потребность клеток в кислороде мо­жет быть обеспечена за счет обдувания поверхности среды возду­хом или же смесью 95 % воздуха и 5 % углекислого газа.

Проблема обеспечения клеток кислородом возникает при крупномасштабных объектах культивирования. Это связано с тем, что кислород очень плохо растворим в культуральных средах, а по­требность клеток в нем и скорость его использования достаточно высокая. И в таких случаях кислород является лимитирующим фак­тором роста клеток в реакторе.

Решение проблемы обеспечения культур клеток кислородом осуществляется интенсивной аэрацией среды стерильным возду­хом и непрерывным контролем концентрации кислорода в среде.

Важным компонентом газовой смеси является двуокись угле­рода, которая может служить источником бикарбоната и поддер­живать величину рН. Для большинства клеток оптимальная кон­центрация С0₂ находится в пределах 0,5-2%.

В процессе культивирования клетки могут инфицироваться различными микроорганизмами (контаминантами). Экономические убытки от контаминации столь значительны, что часто возникает необходимость включения антибиотиков в культуральные среды, что обеспечивает биологическую чистоту культуры. При этом не­обходимо учитывать, что антибиотики угнетают и рост самой куль­туры. Поэтому антибиотики подбирают так, чтобы обеспечить ингибирование роста контаминантов с минимальным ингибированием роста культур клеток.

Наиболее часто применяют такие антибиотики как пенициллин (100 МЕ/мл), стрептомицин (50 мкг/мл) или гентамицин (50 мкг/ мл), которые являются мощными антибактериальными агентами. В качестве противогрибковых агентов используют амфотерицин В (25 мкг/мл) или нистатин (25 мкг/мл).

«Неопределенные» биологически активные добавки к сре­дам для культивирования клеток

Питательные среды не способны обеспечить интенсивный рост клеток в культуре. В таких средах (среда Игла, среда 199, среда Хепа Б-10), клеточные культуры способны сохраняться в хорошем состоянии в течение нескольких недель и их свойства остаются неизменными. Такие среды называют поддерживающи­ми средами. Внесение в поддерживающие среды сыворотки крови новорожденных телят или лошадей в концентрациях от 0,5 до 30 % по объему обеспечивает рост культуры клеток млекопитающих в системе in vitro. И в таком случае такие среды называют росто­выми. Необходимо отметить, что телячья эмбриональная сыворот­ка превосходит по ростовым свойствам другие виды сывороток. Установленным фактом является то, что в сыворотке высокое со­держание биотина и других факторов роста.

Сыворотку получают либо от эмбрионов, либо от новорожденных телят. Получение сыворотки, ее обработка и стерилизация достаточно сложные задачи, решение которых требует специальной аппаратуры. При получении сыворотки необходимо устранить гемолиз эритроци­тов, осуществить ее очистку от вирусов, микоплазм и бактерий. Для этого ее фильтруют через серию фильтров с диаметром пор до 0,1 мкм. Тестируют на отсутствие вирусов и способность обеспечивать рост клеток в культуре. Разные партии сыворотки крови могут существен­но различаться по своим ростовым свойствам. Полученную сыворотку хранят при минус 20°С, ежемесячно проверяют ее свойства, она мо­жет храниться 6 и более месяцев, повторных циклов замораживания-оттаивания не допускается.

Сыворотка содержит более 1000 различных молекул, и пока еще не установлена связь между биохимическими и биофизическими свойства­ми сыворотки и ее способностью ускорять рост клеток т уНго. Однако целый ряд функции сыворотки в росте клеток уже установлен (табл. 21).

Использование сыворотки в питательных средах создает и це­лый ряд серьезных проблем (табл. 22). И эти проблемы, по мнению многих специалистов, могут быть решены только путем перехода на так называемые бессывороточные среды или среды с определен­ным составом.

Бессывороточные среды

Использование бессывороточных сред или сред с заменой наи­более важных для роста клеток компонентов сыворотки позволяет: улучшить воспроизводимость экспериментальных результатов и обеспечить стабильную продуктивность культур; значительно сни­зить вероятность заражения культуры вирусами или микоплазмами. Использование таких сред позволяет обеспечить относительно простую систему очистки продуктов метаболизма клеток.