Рост клеток в культуре

Рост клетки - это увеличение ее биомассы. Рост биомассы мо­жет быть обеспечен за счет увеличения средней массы клеток (ги­пертрофия) или числа клеток (гиперплазия). Так как гипертрофия в норме находится под жестким контролем, то в понятие «рост» большей частью вкладывают увеличение числа клеток в культуре.

Пролиферация клеток является одним из фундаментальных свойств клетки. Процесс размножения клеток состоит из сово­купности последовательных, связанных между собой событий. Последовательный ряд совокупности молекулярных событий меж­ду митотическими делениями клеток называют клеточным циклом. По различию синтетических процессов, происходящих в клеточ­ном цикле, его делят на 4 основные фазы. Легче всего идентифи­цируются фаза митоза (М), во время которой осуществляется де­ление клетки и так называемая синтетическая фаза , во время которой происходит удвоение ДНК. Между ними разделяют две фазы - (G ) и (G₂), во время которых осуществляется подготовка к прохождению S-фазы (G и митоза (G₂). Характеристика интен­сивности синтеза ДНК, РНК и белков во время клеточного цикла представлена на рис. 126.(в раздаточн. материале)

Существует точка зрения, согласно которой клетки осуществля­ют пролиферацию до тех пор, пока не будет получен сигнал, останав­ливающий рост (отсутствие питательных веществ, появление в сре­де специфических ингибиторов роста, ограничение пространства). Однако клетка может остановить движение по циклу только в G - периоде, в том случае, если появление фактора, ингибирующего деле­ние клетки, «застанет» клетку в S или G₂, то такая клетка перейдет к митозу. Для удобства, то состояние, когда клетки, находясь в G фазе, перестают проходить по клеточному циклу, называют G₀-фазой «по­коя». Клетки из G₀-фазы могут осуществлять движение по циклу при устранении фактора, ингибирующего деление. Для объяснения перехода клеток из G₀ в цикл было введено понятие о точке «пере­ключения» в G - фазе. «Переключение» может осуществляться специфическими высоколабильными белками.

Существует гипотеза, согласно которой в трансформирован­ных клетках отсутствует G₀-период, что и обеспечивает им непре­рывный рост.

Согласно альтернативной гипотезе (непрерывной модели) ре­гуляция движения клеток по циклу осуществляется способностью клетки проходить S-период, т.е. синтезировать ДНК. Инициатор синтеза ДНК в клетке образуется непрерывно, однако он включает синтез только после достижения порогового уровня. Если синтез инициатора снижается и его концентрация остается ниже порого­вой, то клетки не вступают в S-фазу (рис. 126).

Тот факт, что для размножения клетка должна пройти ряд по­следовательных молекулярных событий указывает на то, что она может находиться в различных функциональных состояниях и обладать разной чувствительностью к действию факторов сре­ды (лекарственные препараты, факторы роста, и др.) Исходя из этого, становится ясным почему клетки столь гетерогенны и для получения однотипных по свойствам (гомогенных) клеток необ­ходимо осуществлять их синхронизацию. В синхронной культуре все клетки одновременно проходят стадии клеточного цикла. Это особенно важно при использовании клеток в биотехнологических процессах, а также при оценке действия медицинских препаратов.

ХАРАКТЕРИСТИКА СРЕД ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ

Сбалансированные солевые растворы

Среда для культивирования клеток должна обеспечить необ­ходимые условия поддержания структуры и функциональной ак­тивности клеток. Учитывая то, что в процессе жизнедеятельности клетки непрерывно изменяют состав среды, она должна обладать достаточной буферной емкостью, чтобы устранить процесс ингибирования роста клеток. При составлении питательных сред необ­ходимо решить две трудно совместимые задачи.

Во-первых, необходимо максимально воспроизвести состав природного окружения клетки. Однако полный состав природных сред клеток еще до конца не расшифрован и он достаточно динамичен, а, следовательно, состав природных сред (тканевые экстракты) не может быть стандартизирован. Многие специалисты видят решение этого вопроса в разработке так назы­ваемых бессывороточных сред.

Во-вторых, для интенсивного роста клеток необходимо кон­тролировать условия и состав компонентов среды, который по­стоянно меняется, т. е. он высокодинамичен. Моделировать эти процессы в полном соответствии с живой системой сегодня прак­тически невозможно. Поэтому при решении этих задач выбирают­ся компромиссные решения.

Питательные среды для выращивания клеток должны удовлет­ворять двум основным требованиям: 1) - поддерживать физико-химические условия существования клеток: осмолярность, концен­трацию ионов водорода, необходимый ионный состав и буферную емкость; 2) - обеспечивать клетки питательными веществами, не­обходимыми для синтеза органических веществ (биомассы и про­дуктов жизнедеятельности).

В зависимости от меры удовлетворения этим требованиям пи­тательные среды могут быть разделены на сбалансированные со­левые среды и ростовые среды.

Практически все сбалансированные солевые растворы явля­ются производными физиологического раствора, который был разработан Рингером в 1895 г. В состав раствора Рингера входят три катиона - кальций, натрий и калий в таких пропорциях, в ка­ких они находятся в морской воде или крови высших животных. Первым сбалансированным солевым раствором, предназначенным для клеток млекопитающих, был раствор Тироде.

В настоящее время наиболее широко используются среды Эрла (1934), Хенкса (1948) и Дульбекко и Фогта (1964). Солевой фосфатный бу­фер Дульбекко и Фогта используется для промывания клеток и как основа для раствора трипсина. Состав некоторых солевых растворов представлен в таблице 19. Поддержание значений рН в диапазоне 7,2-7,5 обеспечивается системой бикарбонат/ С0₂. При концентрации С0₂ в воздухе до 5 % обеспечивается величина рН среды до 7,4. При этом среда Эрла окрашивает­ся в томатный цвет (что позволяет осуществлять визуальный контроль величины рН) благодаря присутствию в ней фенол­фталеина. При подщелачивании среды ее цвет меняется на красный, а при подкислении - она становится желтой. Так как в процессе жизнедеятельности клетки вырабатывают кислоты, то среда может подкисляться. В настоящее время для обеспечения буферной емкости вместо бикарбоната используют буфер Нереs.

В таком случае отпадает необходимость поддерживать 5 %-ную концентрацию С0₂ в газовой фазе культуры. Однако бикарбонат используют при клонировании клеток, в связи с чем используется смесь буфера Нереs и бикарбоната, а клетки растут при 2 % концен­трации С0₂ в воздухе. Кроме буфера Нерes, в средах для клеточных культур используются и другие цвиттер-ионы.

Ростовые среды.

Основной состав ростовых сред

В основе выбора питательных сред лежат такие особенности как: 1) потребность данного типа клеток в питательных веществах; 2) известный химический состав среды, что может обеспечить ста­бильность культивирования; 3) стоимость среды; 4) необходи­мость учета опыта культивирования клеток на выбранной среде.

Полная оптимизация состава питательных сред достаточно сложная задача и должна решаться отдельно для конкретного типа клеток. Это связано с тем, что потребность в компонентах пита­ния для различных типов клеток различна. Так как использование клеток млекопитающих в промышленных технологиях возрастает, все большее значение придается фундаментальным исследованиям количественных аспектов культивирования клеток.

Для получения данных о количественных параметрах ростовых сред необходимо знать влияние концентрации питательных веществ на скорость роста клеток и их урожайность на единицу массы исполь­зованного питательного вещества. Показано, что скорость использо­вания глюкозы варьирует с изменением величины рН и зависит от стадии роста клеток и типа клеток, точнее, их генотипа (табл. 20).

Как видно из данных, представленных в таблице 20, урожай­ность разных типов клеток может различаться в десятки раз, что отражает различия типов клеток и условий культивирования.

Культивируемые клетки требуют большое количество таких аминокислот как цистин и глутамин. Такая высокая потребность в глутамине обусловлена его низкой стабильностью в средах для культивирования. Он может распадаться до пирамидона, карбоновой кислоты и аммиака. На урожайность клеток влияют такие факторы как скорость роста, плотность клеток, концентрация сы­воротки, содержание витаминов в среде и др.

Важную роль в урожайности (выходе биомассы) культур кле­ток играют неорганические ионы. Вероятно, для каждого типа клеток существуют пороговые значения концентрации ионов. Так, Бирг Дж. и Пирт С. (1971) показали, что для максимальной ско­рости роста клеток в культуре требуется 0,53 мМ калия, 0,2 мМ магния, 06-1,4 мкм железа, 0,6 мкмоль цинка и 30 нмоль селена.

На скорость использования различных компонентов среды влияет целый ряд факторов, которые в конечном счете и определя­ют урожайность культуры (рис. 127).

Традиционным источником углерода в средах является глю­коза, которую вносят в концентрациях 5-20 мМ. Необходимо учитывать, что применение глюкозы в больших концентрациях мо­жет ингибировать рост культуры. Это связано с тем, что быстрое превращение глюкозы в лактат может приводить к снижению рН среды (закисление), что сопровождается ингибированием роста культуры. Для устранения этого эффекта и поддержания рН на не­обходимом уровне автоматически контролируется величина рН и в случае необходимости добавляется щелочной раствор.

Другим основным источником энергии в большинстве сред является глютамин, который вносится в концентрациях 0,7-5 мМ. Так, например, в культуре диплоидных фибробластов человека при культивировании в обычной среде с сывороткой около 30 % по­требности клеток в энергии обеспечиваться глютамином.

Еще одним подходом в устранении избыточного накопления лактата в среде является использование фруктозы или галактозы вместо глюкозы. Кратко рассмотрим характеристики основных компонентов питательных сред.

Аминокислоты

Для культивируемых клеток животных незаменимыми счита­ются 13 аминокислот, которые включаются в состав ростовых сред. В некоторых случаях существует специфическая потребность в аминокислотах, например серине для лимфобластных линий кле­ток. Глютамин вносится в состав среды в 10 раз больше других ами­нокислот, это связано с тем, что он играет важную роль в энергети­ческом обмене и синтезе нуклеиновых кислот.

Витамины

Лучше всего изучено влияние на рост клеток в культуре водо­растворимых витаминов группы В. Для многих клеток в культуре необходим биотин, фолиевая кислота, никотинамид, пантотеновая кислота, пиридоксин, рибофлавин и тиамин. Водорастворимые ви­тамины выполняют функцию коферментов.

Потребность клеток в таких водорастворимых витаминах: аскорбиновой кислоте, р-аминобензойной кислоте, кобаламине изучена в меньшей степени.

В меньшей степени изучено и влияние жирорастворимых ви­таминов на культуру клеток. Пожалуй лучше других изучено влия­ние витамина А и Е (а-токоферола), которые входят в состав сре­ды 199.

Основные неорганические ионы

Урожай клеток зависит от соотношения различных ионов (особенно ионов натрия и калия) в питательной среде. Кроме этих ионов для роста культуры необходимы: кальций, магний, фосфор, сера, бикарбонат и хлорид.

Микроэлементы

Считается, что для клеток животных жизненно необходимыми являются такие элементы как: Со, Сu, I, Fe, Мn, Мо, Zn, Se, Сг, Ni, V, Аs, Si, Sn, которые обеспечивают регуляцию метаболизма клетки.

Предшественники нуклеиновых кислот

Хотя клетки в системе in vitro способны синтезировать пурины и пиримидины, внесение предшественников нуклеиновых кислот, т аких как оротовая кислота, аланин, цитидин, тимидин и гипоксатин в концентрациях 10 ^-5 – 10 ^-7 М увеличивает урожайность клеточных культур.

Липиды

Источником липидов в ростовых средах является сыворотка, которая содержит неэстерифицированные жирные кислоты, хо­лестерин, триацилглицериды и фосфолипиды. Такие комплексные среды как Р12 и 199 содержат линолевую кислоту и холестерин со­ответственно. Существуют указания, что липиды являются груп­пой низкомолекулярных соединений очень важных для роста кле­ток в культуре.

Кроме источника энергии, липиды являются компонентами клеточных мембран и предшественниками синтеза простагландинов. К незаменимым относятся такие жирные кислоты как олеи­новая (18:1n=9), линолевая (18:2n= 6) линоленовая (18:3n=3) и арахидоновая (20:4n=б), а также холестерин и фосфолипиды. В ростовые среды их вводят в виде липосом. В состав липосом вклю­чают такой антиоксидант как витамин У, что предотвращает окисле­ние липидов. Клетки млекопитающих могут использовать этаноламин для синтеза фосфотидилэтаноламина. Для роста гибридомных клеток этаноламин является обязательным компонентом среды.