Протиправцева сироватка.

Протиправцеву сироватку одержують шляхом гіперімунізації коней правцевим антигеном (анатоксином або токсином) з наступною її очисткою і концентруванням. Серед колекції штамів ГІСК імені Л. Л. Тарасевича заслуговують на увагу штами Г № 54 і 288 (Каталог штамів, 1963). Для отримання правцевого токсину застосовують м'ясні поживні середовища: Легру, Рамона і гідролізоване середовище Глузмана (Ю. А. Козлов, 1950). Середовище Глузмана стерилізують в бутлях при 110° С протягом 30 хв. Після стерилізації в середовище при 35°С засівають 5-10 мл рідкої культури . Культивування проводиться при З5°С протягом 6-8 діб. Токсиноутворення супроводжується газоутворенням. Найбільш інтенсивне розмноження мікроба спостерігається в період між 36 і 72 год інкубації. На дні бутля утворюється осад з мікробних клітин. Правцевий токсин переводять у анатоксин шляхом добавляння в препарат формаліну і витримування суміші в термості 20-25 днів при 39°С до повного знищення мікроорганізмів. Для гіперімунізації коней-продуцентів використовують анатоксини, виготовлені з токсину з активністю 800 000-1600 000 Dlm і вище. Для гіперімунізації коней може бути використаний і правцевий токсин, але після підготовчого циклу, проведеного правцевим анатоксином. Після очищення та концентрування, контролюють фізичні властивості сироватки, стерильність, апірогенність, специфічну активність, нешкідливість, вміст білка, рН, вміст залишкового сульфату амонію. Після виробничого контролю кожна серія сироватки поступає в ОБК, де контролюють також фізичні властивості, стерильність, специфічну активність після 20 денної витримки при 37°С, апірогенність і рН. Після проведення контролю ОБК дає дозвіл на розлив сироватки.

Контроль сироватки на піроген. Для виявлення пірогена дослід ставлять на здорових кролях різної статі масою 1,5-2,5 кг, переважно породи шиншила, що утримуються на повному раціоні. Кроликів відбирають по масі за 3 дні до досліду. Кожного кролика садять в окрему клітку. Використану сироватку підігрівають до 37°С і вводять у вушну вену в кількості 1 мл на 1 кг маси кролика, якщо після повторного досліду у 3 або більше з 6 кроликів відзначається підняття температури на 0,8°С і вище, сироватка вважається пірогенною.

Контроль стерильності проводять в асептичних умовах в боксах. Допустимим вважається ріст не більше п’яти колоній сапрофітних мікробів на одній чашці Петрі.

Контроль нешкідливості

Нешкідливість сироватки перевіряють із кожного бутля, які входять до складу серії, на одній морській синці масою 300-400 г, веденням їй підшкірно 10 мл препарату ( по 5 мл в обидва боки). Будь-яка реакція повинна бути відсутня

Визначення активності протиправцевої сироватки

Титрування протиправцевої сироватки засноване на властивості токсину, виділеного збудником, спричиняти смерть мишей і здатності протиправцевої сироватки нейтралізувати ці здатності токсину. Активність сироватки виражають в міжнародних антитоксичних одиницях (МЕ).

Протидифтерійна сироватка

Діючою основою протидифтерійної сироватки служить імунна глобулінова фракція, отримана з крові коней, гіперімунізірованних дифтерійним анатоксином.

Для отримання протидифтерійної сироватки імунізують коней дифтерійним анатоксином. Культуру яку вирощували 2 дні засівають на стерильний бульйон Мартена з 0,2% глюкози і культивують при 34-35°С протягом 7-10 днів. Специфічна активність токсину характеризується двома показниками: специфічною токсичністю, що визначається на морських свинках (Dlm), і антигенною активністю, яка визначається реакцією флокуляції (ЛФ).

Для отримання анатоксину до стерильного фільтрату токсину додають 0,4% формаліну (з розрахунку на 40% розчин формальдегіду). Знезараження проводять в термостаті протягом 30-32 днів при 40°С. Гіперімунізація коней таким анатоксином дає можливість отримати нативні протидифтерійні сироватки з достатньо високим рівнем анатоксину. Нативні сироватки в подальшому очищають та концентрують. Біологічна активність сироваток при зберіганні при 4°С не змінюється довгий час. Готова протидифтерійна сироватка повинна бути стерильною, апірогенною, не шкідливою. Вміст білку не повинно перевищувати 15%, рН має бути в межах 6,9 - 7,2, Мінімально допустимий кількість антитоксину на 0,1 г білка повинно бути це менше 1200 МЕ. Визначення специфічної активності протидифтерійних сироваток засноване на їх здатності нейтралізувати некротичну дію дифтерійного токсину в досліді на лабораторних тваринах. Антитоксичну активність визначають за допомогою реакції флокуляції.

Титрування сироватки реакцією флокуляції.

Титрування протидифтерійної сироватки за допомогою реакції флокуляції засноване на тому, що у суміші токсину або анатоксин з певною кількістю сироватки спостерігають помутніння і випадання рихлого осаду флокуляту (комплекс антиген-антитіло).

Титрування протидифтерійної сироватки проводять токсином (анатоксином), у якому попередньо встановлено вміст антигенних одиниць (ЛФ) у 1 мл. Одну антигенну одиницю (ЛФ) токсину (анатоксину) нейтралізує одна антитоксинова одиниця (1 МЕ) протидифтерійної сироватки. Визначення якості антигенних одиниць у токсині (анатоксині) здійснюють за допомогою стандартної протидифтерійної сироватки. До ряду пробірок розливають різні кількості розведеної стандартної сироватки, наприклад 0,1 0,15-0,2-0,25 мл, і додають по 2 мл токсину або анатоксину. У пробірці з ініціальною флокуляцією міститься стільки ж антигену, стільки й антитоксичних одиниць (МЕ) стандартної сироватки. Якщо, наприклад, ініціальна флокуляція наступила в суміші, де до 2 мл токсину або анатоксину добавлено 0,2 мл стандартної флокуліруючої сироватки, розведеної до вмісту 200 МЕ в 1 мл, то кількість антигенних одиниць токсину або анатоксину в 1 мл буде так само 20.

Визначення дифтерійного антитоксина методом Ремера

Титрування по Ремеру базується на властивості дифтерійного токсину при підшкірному введенні викликати у морських свинок некроз тканині і на здатності протидифтерійної сироватки нейтралізувати цю дію токсину. Для титрування сироваток застосовують дифтерійний токсин, витриманий під толуолом в холодильнику не менше 12 місяців з вититрованою дослідною некротичною дозою Ln/50. Титр протидифтерійної сироватки для випуску визначають, виходячи із найбільшого розведення сироватки, в суміші з якою дослідна доза токсину не дає реакції на місці введення до останнього дня досліду.

Призначення і застосування препарату. Очищена концентрована протидифтерійна сироватка застосовується для специфічної терапії дифтерії. Сироватку вводять у ранній термін захворювання підшкірно та внутрішньом'язово в кількості 5000-15 000 МЕ залежно від тяжкості хвороби. Протидифтерійну сироватку випускають у запаяних ампулах по 5 мл (10000 МЕ) або 10 мл (20000 МЕ). Сироватку зберігають у сухому, захищеному від світла місці при температурі 3-10°С. Термін придатності 2 роки.

ПРОТИГАНГРЕНОЗНІ СИРОВАТКИ

Газова гангрена відноситься до раневих інфекцій, викликається спороносними анаеробами, (Cl. perfringens, Cl. oedematiens, Cl. Septicum та ін.) які живуть у грунті. Вперше сироватку проти газової гангрени було отримано Лекленшем і Морелем в 1898 р. від осла шляхом імунізації культурою Сl. septіcum , але на людях вона не була використана. У Радянському Союзі сироватки проти гангрени були виготовлені в 1930 р. І. М. Велікановим. Перше масове застосування цих сироваток в СССР було здійснено в воєнних умовах на озері Хасан і Халхін-Гол. У наш час випускають полівалентну сироватку проти гангрени з високим вмістом специфічних антитоксинів. Полівалентну сироватку отримують шляхом гіперімунізації коней комплексом гангренозних антигенів. Для їх виготовлення використовують високотоксигенні штами збудників газової гангрени, апробованні в ГИСК імені Л.А. Тарасевича. Для отримання токсину перфрінгенс застосовують культуру Cl. рerfrіngens штам 28 ВР 6К, вирощену на м'ясних або казеїнових середовищах. Ріст культури продовжується від 6 до 18 год. при 34-37°С. Джерелом вуглеводів є 0,5% розчин глюкози або декстрину. Культуру сепарують на сепараторі марки АСГ-ЗМ. Для гіперімунізації коней зазвичай використовують концентрований антиген, для чого застосовують метод двократного осадження токсину Cl. рerfrіngens сульфатом амонію. Сульфат амонію попередньо висушують, подрібнюють, стерилізують сухожаровим методом. Осад який містить антиген і другі білки, використовують для отримання другого концентрату. При висолюванні 20 л токсину осад розчиняють в 0,5 л дистильованої води. Отриманий таким чином перший концентрат піддають вторинному осадженню, але при цьому концентрацію солі беруть із розрахунку 42 г на 100 мл першого концентрату. Отриманий осад другого концентрату розчиняють в нативному токсині із розрахунку 1: 15-1: 20.

Розчинений осад антигену центрифугують і піддають стерілізуючій фільтрації, а потім частково знешкоджують 0,3-0,4% формаліном при 37°С протягом 1 доби. Для отримання токсину Cl. оedematіens (штам № 79), культуру, вирощену протягом 2 діб на напіврідкому середовищі, пересівають на кислотний гідролізат казеїну або м'ясне середовище, що містить 0,5% глюкози або декстрину, інкубують в термостаті протягом 6 доби при 37 ° С. Активність токсину при цьому становить 3000-4000 Dlm/мл, а іноді і вище. Токсин фільтрують через паперові фільтри, натерті крейдою або тальком, після чого піддають стерилізуючій фільтрації та знешкодженню 0,4 - 0, 5% формаліну при 37°С протягом 48 год. Отриманий анатоксин додатково витримують 5 діб при. кімнатній температурі, досліджують на нешкідливість, стерильність, зв’язуючу здатність антитоксину потім використовують для гіперіммунізації коней. Зберігають анатоксин при: температурі 8°С. Допускається зберігання і при кімнатній температурі.

Для отримання токсину септичного вібріону застосовують культуру С1.septicum, штам № 59, яку вирощують на середовищі із панкреатичного гідролізату казеїну, або на м'ясних середовищах. Для посіву використовують добову культуру, вирощену на напіврідкому середовищі, на якій зберігають штам. До середовища додають 1% глюкози. Вирощують при 37°С протягом 18-20 год (при більш тривалому вирощуванні активність токсину знижується). Отриману культуру фільтрують через стерильні ватно-марлеві фільтри, а потім через стерилізуючі пластини фільтра Сальникова. Фільтрацію проводять на хлориду натрію. Допускається сепарування культури па Сепараторі марки АСГ-ЗМ. Токсин перевіряють на стерильність, токсикогенну активність і специфічність. Специфічну активність сироваток визначають біологічним методом на білих мишах.