2.Гіперіммунізація.

Як відомо, для отримання лікувально-профілактичних сироваток використовується метод гіперімунізації тварин, введення їм наростаючих доз відповідних антигенів з метою домогтися найвищої відповідної імунологічної реакції організму, а разом із тим, максимального збільшення у крові тварини такої кількості специфічних антитіл, яка забезпечила б лікувальну і профілактичну здатність сироватки.

Серед факторів які впливають на процес найбільше значення мають індивідуальні особливості тварин, що використовуються у виробництві сироватки, і створення у них грундімунітета з метою забезпечення попередньої імунологічної перебудови організму, також методи гіперімунізаціі тварин, антигени, які застосовуються при цьому і неспецифічні подразники, а також догляд і годування тварин у період експлуатації. У даний час кінь, як біологічна модель для отримання гіперімунних сироваток залишається загальновизнаним продуцентом по комплексу показників (висота титрів антитіл, кількість одержуваної крові, її обробка і вихід сироватки), і тільки цей вид тварин в основному використовують для експлуатації в виробничих масштабах. Відбір продуцента для отримання високоактивних лікувальних сироваток вважається складною процедурою, і його проводять за фізіологічними й імунологічними показниками. При цьому частина тварин (50%) вибраковують їх числа продуцентів із-за їх слабкої реактивності.

Отримання високоактивних лікувально-профілактичних сироваток пов’язано із породою, конституцією, з віком і статтю тварини. За комплексом показників найкращими продуцентами протиправцевої і протидифтерійної сироваток вважаються кобили, потім - жеребці, і гіршими – мерини. Серед коней імунізованих гангренозними антигенами, кращі показники виявились у жеребців, трохи гірші у кобил і погані у меринів. Вік повинен бути 3-5 років. Краще мерини показали себе як продуценти сироваток проти ботулізму. Їх більше використовують як донорів нормальної крові. Але найбільш теоретично обґрунтованим і практично доцільнішим вважається відбір продуцентів за імунологічними показниками.

У комплексі специфічної імунізації коней - продуцентів антитоксичних сироваток можна виділити три основних процеси, які складаються з віддаленого грундування тварин відповідними антигенами, підготовчих циклів гіперімунізаціі і наступних виробничих циклів гіперімунізаціі.

Більш цінними у прогностичному відношенні є спроби використати ступінь наростання титру антитоксину в результаті імунного подразника, що передувало початку гіперіммунізації. Вперше штучний грундімунітет був створений у коней, призначених для виробництва протиправцевої сироватки. В подальшому попереднє грундування отримало поширення і при підготовці коней-продуцентів протигангренозних, протиботулічних, протидифтерійної і інших сироваток. Попереднє грундування коней забезпечує підвищення титрів специфічних антитіл при наступній гіперімунізації тим же антигеном у 5 разів і більше, підвищує вихід так званих ділових продуцентів і створює умови отримання сироваток в більш короткий термін.

Враховуючи великі витрати, пов’язані із забезпеченням коней в підготовчий період, грундування і підготовчий цикл гіперімунізації, а також відбір більш реактивних продуцентів доцільно здійснювати на місці заготовки в господарствах – постачальниках коней. При цьому треба враховувати, що більш віддалене грундування коней забезпечує більш інтенсивне утворення антитіл при наступній гіперімунізації продуцентів. Ефективно грундування коней правцевим анатоксином у віці 1 - 2 роки з наступним використанням цих тварин в якості продуцентів відповідної сироватки у віці 3-4 років.

У даний час застосовують різні методи грундування, зокрема коней, призначених для виробництва протидифтерійної сироватки. Наприклад шляхом підшкірного введення двох доз нативного дифтерійного анатоксину (3 і 6 мл ), емульгованого в ланоліні і рослинній олії (2: 1) з інтервалом між ін'єкціями 21 день, або шляхом введення 5 мл сорбованого і 20 мл. нативного анатоксину з інтервалом між ін'єкціями 21 день з одночасною аплікацією мікродоз дифтерійного токсину (4 і 8 Dlm) у тій же послідовності. Через 30 днів (цей період можна збільшити до 6 міс) після грундування коням проводять підготовчий (перший) цикл імунізації шляхом підшкірного введення нативного дифтерійного анатоксина з 1% хлориду кальцію: (використується в якості ад'юванта), але за схемою: 5-10-20-40 - 80-100 -120-150 мл з інтервалом між ін'єкціями 4 - 5 днів. Чергові дози антигену вводять під контролем наростання рівня анатоксина в сироватці крові коня.

До кінця підготовчого циклу титр анатоксина повинен бути не нижче 600 МЕ / мл. Коней, у крові яких не міститься мінімально допустимої кількості анатоксина, вибраковують. Коням з титром 600 МЕ/ мл і вище на 7-й день після введення останньої дози антигену роблять кровопускання і використовують кров для отримання готового препарату. Через 2 тижні після кровопускання, протягом яких коні відпочивають, проводять другий цикл гіперімунізаціі і т. д. У другому та наступних циклах гіперімунізаціі антиген з 1% хлорид кальцію коням вводять триразово з інтервалом між ін'єкціями 4-5 днів. Схеми введення антигену для кожного продуцента визначають індивідуально залежно від динаміки утворення антитіл у попередніх та даному циклах гіперімунізаціі. У відповідності з цим дози веденого антигена можуть бути малими (20-40-80 мл), середніми (50-100 - 150 мл) і високими (більше 150 мл).

Коней, призначених для виробництва протиправцевої сироватки, попередньо двократно грундують нативним правцевим анатоксином з 1 % алюмо - калієвих галунів у дозах 10 мл при першій і 20 мл при другій ін’єкції антигена з інтервалом між ними 21-30 днів. Інтервал між другим грундуванням і підготовчим (першим) циклом гіперімунізації повинен бути не менше 45 днів.

У підготовчому циклі імунізації проводять нативним правцевим анатоксином за схемою: 5-10-20-40-80-120-150 мл. Інтервал між ін’єкціями витримують 4- 5 днів. Основну вибраковку інертних тварин, як правило здійснюють після підготовчого циклу гіперімунізації. Кількість рефрактерних продуцентів зазвичай становить 15 - 25%. У наступних циклах схеми гіперімунізації коней, призначають строго індивідуально залежно від динаміки накопичення антитоксину в сироватці крові продуцентів у процесі попередньої імунізації. Приблизно вони можуть бути наступними: 40-80-120 мл; 50-100-150 мл; 100-200-300 мл антигена з тим же депонентом, що і в підготовчому циклі. Інтервал між ін'єкціями 4-5 днів. Для гіперімунізації коней - продуцентів протиправцевої сироватки, як правило, використовують нативний правцевий анатоксин і рідше правцевий токсин.

Коней, призначених для отримання протигангренозної полівалентної сироватки, попередньо дворазово грундують гангренозним триантигеном, змішаним з ланоліном і олією; інтервал між ін'єкціями 15 днів. Антиген вводять підшкірно в область шиї. Перша ін'єкція 2 мл токсину перфрінгенс (250 – 300 Dlm/мл), 1 мл анатоксина едематієнс (3000 Dlm/мл вихідного токсину), 2 мл токсина септикум (250-300 Dlm / мл), 10 мл ланоліна, 5 мл олії (соняшникової або оливкової).

Через 15 днів після другого грундування приступають до першого циклу гіперімунізаціі коней, який складається з 7-8 ін'єкцій антигену в кількості 5-10-20-40-80-100-150-200 мл, з інтервалом між ін'єкціями 4-5 днів. Наступні цикли гіперімунізаціі починають з дози, яка відповідає 1/3 останньої дози антигена попереднього циклу. Всього за цикл, коням вводять 3-4 дози антигену; при цьому співвідношення компонентів у триантигені приблизно повинно бути наступним : анатоксину перфрінгенс- 40% , анатоксину едематієнс - 20%, токсина септикум - 40%.

При виробництві моновалентних протигангренозних сироваток (протиперфрінгенс, протиедематієнс, протисептикум) принцип гіперімунізації коней залишається звичним, але для кожного виду сироваток виділяють особливі групи тварин.

Коней, призначених для отримання протиботуличних моновалентних сироваток (А, В, С, Е або F) попередньо дворазово грундують відповідним анатоксином При першому грундуванні підшкірно вводять 5 мл антигену в суміші з 10 мл ланоліну і 5 мл рослинної олії , при повторному ( через 21-30 днів) - 10 мл антигена з 15 ланоліна і 10 мл рослинної олії.

Через 45 – 60 після грундуваня починають підготовчу гіперімунізацію (до трьох циклів). Однак частина коней може бути переведена в « ділові »продуценти вже після першого або другого підготовчого циклу. Перший підготовчий цикл гіперімунізації проводять за схемою; 5-10-20-40-80-100-120 мл антигена з 1% алюмінієво-калієвих галунів. Відсоткове співвідношення депонента необхідно зменшувати в міру збільшення дози антигена. На 0,5% вміст галунів переходять, коли доза антигена перевищує 100 мл, на 0,25% - коли вона становить 200 мл і вище. Інтервал між ін’єкціями 4 – 5днів. На 7 день після останньої дози антигена виконують перше кровопускання.

7 день прийнято вважати днем найвищої кількості антитоксинів у крові продуцента. Після кровопускання коней ставлять на відпочинок на 2 тижні і проводять другий підготовчий цикл імунізації. Через 2 тижні після закінчення другого проводять третій цикл гіперімунізації, що складається з 3 ін'єкцій антигену в дозах від 25до50 мл, від 50 до 100мл і від 100 до 150 мл. У наступних циклах водять також по 3 дози антигена.

Для гіперімунізації коней – продуцентів анатоксичних протиботулінічних сироваток, крім анатоксинів широко використовують відповідні токсини. Перехід коней на імунізацію токсином здійснюють після одного або декількох циклів імунізації анатоксином. Зазвичай такий перехід стимулює антитілоутворення. Отримання протиботулічної полівалентної сироватки проводять за таким же принципом, як і отримання моновалентних, але сумішшю ботулінічних антигенів в (А, В, С, Е або А, В, С, Е, F], проти яких необхідно отримувати сироватку.

Техніка кровопускання

По закінченню циклічної імунізації, коли в сироватці крові тварини накопичується максимальна кількість специфічних антитіл, у коня беруть кров. Частіше це роблять на 7-й день після введення продуценту останньої дози антигену. Кількість забраної крові залежить від живої маси коня, звички її до крововтрат (починаючі цикли чи наступні), кількість передбачуваних кровопускань у даному циклі, висоти титру антитіл і стану здоров'я тварини. До взяття крові продуцентів треба привчати поступово. Прийнято у першому циклі брати в коней крові на 30-35% менше, ніж у коней, що уже пройшли 4-5 циклів експлуатації. У другому, третьому та четвертому циклі кількість крові поступово збільшується. На троєкратне кровопускання тварин переводять не раніше ніж з 4-5-го циклу гіперімунізації.

У коней, які звикли до втрати крові кількість забраної крові повинно рівнятися 1/50 живої маси, на кожні 50 кг маси відбирають 1 л крові, що при середній живій масі продуцента 400-500 кг відповідає 8-9 л крові при першому кровопусканні. При другому (через 48 год); беруть на 1 л, а при третьому (через 48 год після другого) -на 2 л менше крові порівняно з першим кровопусканням. Всього коні служать продуцентами гіперімунних антитоксичних сироваток в середньому 20 циклів, або 2 роки.

Кровопускання проводять за допомогою спеціальної голки довжиною 10-12 см, з діаметром отвору 3-4 мм і товщиною стінки не більше 1 мм. На грушовидну основу голки надівають міцну, еластичну резинову трубку довжиною 160- 190 см і з просвітом 6-7 мм, в середині якої міститься скляний з’єднувач – контролер, а на кінці – скляна зігнута крючком трубка, вмонтована у ватну пробку, вставлену в 10 л бутель з добавкою в нього антикоагулянту. Перед кровопусканням коней не годують протягом 10-12 год. і в першу чергу видаляють концентровані корми із ранкової норми. Таким чином запобігають мутності і загальної хільозності плазми та сироватки. Призначеного на кровопускання коня чистять, вимірюють у нього температуру тіла, заводять у верстат спеціальної операційної. Кров беруть з області шиї з верхньої третини яремної вени. Після кровопускання коня заводять в стайню і відразу дають води.

Техніка тотального кровопускання. Тотальні кровопускання коням роблять тоді, коли на основі загального фізіологічного стану тварин зроблено висновок про недоцільність їх подальшого використання як продуцентів. Після фіксації тварини і підготовки операційного поля розрізають в області шиї сонну артерію, через яку і забирають всю кров. Для отримання більшого об’єму крові коням перед тоталізацією вводять серцеві препарати.

Утримання коней-продуцентів. Коні повинні бути абсолютно здоровими. З завезенням на підприємство (інститут) їх 45 днів витримують в карантинно-імунологічній клініці. При відсутності протипоказань та закінчення карантинного терміну коней переводять у виробничу імунологічну клініку. Залежно від загального стану тварин починають імунізувати через 21-45 днів, але не раніше 21 дня. Щоб уникнути виникнення і розповсюдження інфекції імунологічні клініки будують по принципу окремих ізольованих секцій у кожній з яких міститься 30 коней. Захворівших коней терміново переводять в ізолятор.