Работа №11. Определение рибофлавина в инъекционном растворе способом градуировочного графика

Для проведения количественного флуориметрического анализа необходимо установить функциональную связь между интенсивностью флуоресценции раствора люминофора (I_фл.) и его концентрацией (c). Допустим, что аналитический сигнал формирует истинный нерассеивающий раствор, помещённый в кубическую кювету с длиной ребра l. Расположим кювету в прямоугольной системе координат (x, y, z). Плоскопараллельный пучок первичного излучения с длиной волны ₀ интенсивностью I₀ проходит сквозь кювету вдоль оси x. Вторичное излучение люминофора с длиной волны _фл. отбирается под прямым углом к потоку возбуждающего света вдоль оси y. На расстоянии x от стенки кюветы интенсивность флуоресцентного излучения испущенного элементарным объёмом раствора dV=dxdydz пропорциональна

где _к. – квантовый выход флуоресценции, ₀ – коэффициент поглощения первичного излучения люминофором. При прохождении сквозь раствор интенсивность первичного излучения уменьшается за счёт поглощения молекулами люминофора и сопутствующими компонентами (эффект внутреннего фильтра). По закону Бугера – Ламберта:

где k₀ – коэффициент экстинкции раствора для первичного излучения. Этот коэффициент, по закону Бера, пропорционален концентрации поглощающих частиц (c_i). Принимая во внимание закон Фирордта:

где _0,i – коэффициент поглощения возбуждающего излучения i-м компонентом. Возникшее в элементарном объёме раствора dV флуоресцентное излучение ослабляется в направлении детектора при прохождении через слой раствора толщиной y, вследствие поглощения молекулами люминофора и сопутствующими компонентами (эффект реабсорбции):

где k_фл. – коэффициент экстинкции раствора для вторичного излучения

а  _фл.,i – коэффициент поглощения флуоресцентного излучения i-м компонентом. Полную интенсивность вторичного излучения можно получить, интегрируя по всему объёму раствора люминофора:

Используя основной закон поглощения света и базовые соотношения для оптической плотности (A) и пропускания (T) раствора, данное выражение можно переписать следующим образом:

Константа в правой части уравнения учитывает, в первую очередь, аппаратные факторы – долю флуоресцентного излучения, попавшего в монохроматор, пропускание спектрометра, эффективность детектирования и др.

Если раствор люминофора слабо поглощает первичное и вторичное излучение и k₀l и k_фл.l < 0,05 , т.е. эффекты внутреннего фильтра и реабсорбции практически не выражены, формула для интенсивности флуоресцентного излучения значительно упрощается:

поэтому

Цель данной работы – флуориметрическое определение содержания рибофлавина в инъекционном растворе. Для выполнения работы необходимо выбрать длины волн первичного и вторичного излучений, построить градуировочный график и с его помощью определить содержание рибофлавина в анализируемом растворе.

Реагенты, аппаратура, посуда

• Стандартный раствор рибофлавина 10 мкг/мл.

• Раствор рибофлавина мононуклеотида в инъекциях (ампулы).

• Спектрофлуориметр «Флюорат-02-Панорама».

• Кварцевые кюветы, l = 1 см.

• Мерные колбы ёмкостью 25,0.

• Пипетки, 1,00; 2,00 и 5,00 мл.

Выполнение определения

На основании спектров поглощения и флуоресценции, измеренных в предыдущей работе выбирают оптимальные длины волн возбуждения и измерения интенсивности флуоресценции. В пяти мерных колбах ёмкостью 25,0 мл готовят серию растворов рибофлавина с содержанием (мкг/мл): 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 и 1,0. Следует уделить особое внимание чистоте используемой посуды и кювет. Мерные колбы тщательно промывают раствором соды, а кюветы  концентрированной соляной кислотой (под тягой), после чего многократно ополаскивают их водопроводной и два раза дистиллированной водой. Измеряют интенсивность флуоресценции контрольного опыта (дистиллированная вода) и растворов стандартной серии в порядке увеличения концентрации люминофора (длина оптического пути – 1 см). По полученным данным строят градуировочный график в координатах интенсивность флуоресценции – концентрация рибофлавина, мкг/мл. Анализируемый инъекционный раствор в мерной колбе ёмкостью 25,0 мл разбавляют до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают. Содержание рибофлавина в анализируемом растворе находят по градуировочному графику, измерив интенсивность его флуоресценции. В заключение проводят 10 измерений интенсивности флуоресценции раствора контрольного опыта и рассчитывают предел обнаружения (с_min) методики определения рибофлавина по 3s-критерию:

,

где s₀ – стандартное отклонение результатов контрольного опыта (n = 10), S – среднее значение крутизны градуировочного графика. Величину предела обнаружения выражают в мкг/мл и моль/л.

Вопросы для подготовки к коллоквиуму

1.	Укажите особенности молекулярной структуры (электронного строения) органических (неорганических) люминофоров.
2.	Что такое спектры возбуждения и флуоресценции? Дайте определение.
3.	В чём состоят основные различия между двумя видами молекулярной люминесценции – флуоресценцией и фосфоресценцией?
4.	На одном рисунке изобразите спектры поглощения, флуоресценции и фосфоресценции одного и того же люминофора. Объясните их взаимное расположение при помощи диаграмм Яблонского.
5.	Какая область спектра флуоресценции – коротковолновая или длинноволновая – подвержена наибольшим искажениям вследствие самопоглощения (реабсорбции). Ответ поясните графически.
6.	Какую информацию может извлечь химик-аналитик из спектров возбуждения (поглощения) и флуоресценции при разработке методики определения люминофора в растворе?
7.	Зависит ли форма спектра флуоресценции от энергии возбуждающего излучения? Обоснуйте ответ.
8.	Приведите уравнение, связывающее квантовый и энергетический выходы люминесценции. Какая из указанных величин больше? Поясните физический смысл полученного математического выражения.
9.	Перечислите основные требования, предъявляемые к источнику излучения в молекулярной люминесцентной спектроскопии.
10.	В каком методе анализа – спектрофотометрическом или люминесцентном – флуктуации интенсивности источника излучения сильнее сказываются на погрешности измерения аналитического сигнала?
11.	Почему в люминесцентном анализе увеличение мощности источника излучения не всегда сопровождается пропорциональным ростом чувствительности определения люминофора? Какой фактор ограничивает чувствительность флуориметрических методик определения?
12.	Сравните оптическую схему спектрофотометра и спектрофлуориметра. Почему интенсивность люминесценции, как правило, измеряют под углом 90 к направлению распространения возбуждающего излучения?
13.	Что понимают под тушением люминесценции? Перечислите основные причины, вызывающие это явление.
14.	Как и почему влияет температура на интенсивность молекулярной люминесценции?
15.	Почему на спектрофлуориметрах без полноценного монохроматора возбуждающего излучения устанавливают абсорбционные светофильтры, поглощающие длинноволновую часть спектра источника излучения?
16.	Назовите причины нелинейных искажений градуировочной зависимости в люминесцентном анализе в области малых и больших концентраций.
17.	Назовите способы повышения селективности флуориметрического метода.
18.	Сравните и объясните различия аналитических возможностей люминесцентного и спектрофотометрического методов.

Приложение