2.2. Флуориметрический метод анализа

Все вещества при нагревании испускают электромагнитное излучение, причём количество лучистой энергии увеличивается с ростом температуры. Однако некоторые вещества способны излучать свет как при комнатной, так и при более низкой температуре после нетеплового (радиационного, ультразвукового, биохимического и др.) возбуждения. Этот процесс называют люминесценцией. Неравновесное люминесцентное излучение представляет собой избыток над тепловым излучением вещества, т.е. над тем количеством лучистой энергии, которое оно может испустить при данной температуре в термодинамически равновесных условиях. Особого упоминания заслуживает фотолюминесценция, обусловленная возбуждением молекул органических и неорганических веществ электромагнитным излучением УФ и видимого диапазонов длин волн. Соответствующая разновидность люминесцентного (или флуориметрического) метода нашла широкое применение в аналитической химии во второй половине прошлого века. Серьёзный вклад в становление метода внесли советские физики С.И Вавилов, В.Л. Лёвшин и др.

2.2.1. Физические основы

Фотолюминесценция вещества представляет собой сложный процесс, состоящий из нескольких стадий. Две важные с экспериментальной точки зрения стадии – зондирование вещества и его отклик – следует выделить особо. Сначала в результате поглощения первичного фотона увеличивается внутренняя энергия молекулы. На заключительном этапе при излучательной релаксации молекула избавляется от большей части полученной энергии, рождая вторичный фотон. Наличие этих двух стадий роднит флуориметрический метод как с абсорбционными, так и эмиссионными методами. Поэтому для описания процесса фотолюминесценции вещества необходимо измерить не один, а два спектра – поглощения (возбуждения) и испускания. Отличаются ли они от абсорбционных и эмиссионных спектров свободных атомов в газовой фазе?

Внутренняя энергия атома определяется только энергией связанных электронов. Поэтому изменение этой энергии при поглощении или испускании фотона сопровождается лишь электронными квантовыми переходами. Оптические спектры свободных атомов имеют дискретную структуру, в которой каждому переходу соответствует отдельная линия. Положение абсорбционной линии в спектре совпадает с положением соответствующей эмиссионной линии атомов данного элемента. Частичная потеря избыточной внутренней энергии при безызлучательной релаксации в случае столкновения атомов не приводит к смещению линий в спектре.

У молекулы больше степеней свободы. Ядра входящих в её состав атомов могут совершать колебательное и вращательное движение друг относительно друга. Поэтому внутренняя энергия молекулы складывается из трёх составляющих, а её изменение при поглощении или испускании фотона сопровождается комбинированными электронно-колебательно-вращательными переходами. Различие природы и взаимосвязь этих составляющих обусловливает возможность как независимого изменения, так и взаимного перехода одного вида внутренней энергии в другой. Поэтому широкополосные (см. раздел 2.1.1.) молекулярные спектры поглощения и испускания вещества в конденсированной фазе должны заметно отличаться. После поглощения оптического фотона за время порядка

молекула приобретает избыточную энергию, как правило, не только электронную, но и колебательную. Избавится от избытка электронной энергии молекула может, испустив вторичный оптический фотон в результате разрешённого (!) излучательного перехода. Данный вид люминесценции называют флуоресценцией. Время жизни возбуждённого электронного состояния атома и молекулы сопоставимо (~10^-8 с). Однако в конденсированной фазе в результате постоянного межмолекулярного взаимодействия и возмущения валентных орбиталей оно сокращается. Возбуждённая молекула может оказаться в основном электронном состоянии за счёт других квантовых переходов как излучательных, так и безызлучательных. В зависимости от природы люминофора, растворителя и температуры раствора время жизни возбуждённого электронного состояния и, соответственно, длительность флуоресценции изменяется в интервале 10^-10 – 10^-7 с.

Избавится от избытка колебательной энергии молекула может в результате безызлучательного квантового перехода. Колебательная релаксация – более эффективный процесс, чем флуоресценция. Непосредственная передача избытка внутренней энергии между молекулами люминофора и растворителя осуществляется за время сопоставимое с периодом колебания связанных атомов:

Следовательно, время жизни молекулы на возбуждённом колебательном уровне много меньше (на 3 – 6 порядков) среднего времени жизни возбуждённого электронного состояния. Поэтому ещё до начала флуоресцентной релаксации все возбуждённые молекулы люминофора оказываются на одном и том же (!) стационарном уровне – на нижнем колебательном уровне первого возбуждённого электронного состояния – независимо от количества энергии, полученной при поглощении первичного фотона. А это означает, что профиль спектра люминесценции не зависит от длины волны возбуждающего света (правило Каши). Главное, чтобы энергии фотона было достаточно для возбуждения связанного электрона.

Далее, при колебательной релаксации возбуждённых молекул люминофора часть поглощённой лучистой энергии обязательно переходит в тепловую, т.е. идёт на нагрев раствора:

По закону сохранения, энергия испущенных молекулами вторичных (флуоресцентных) фотонов в среднем меньше энергии поглощённого (возбуждающего) излучения. Поэтому спектр люминесценции сдвинут относительно спектра поглощения в более длинноволновую (низкоэнергетическую) область (закон Стокса – Ломмеля). Эти спектры, как правило, частично накладываются друг на друга, что связано с конечной заселённостью нижних возбуждённых колебательных уровней основного электронного состояния молекулы люминофора при комнатной и даже более низкой температуре и, соответственно, возможностью поглощения молекулой фотона с энергией меньшей энергии «чистого» электронного перехода.

Флуоресценция не единственный вид излучательной релаксации. При понижении температуры раствора и увеличении вязкости растворителя время жизни возбуждённого электронного состояния молекулы люминофора возрастает, что способствует протеканию конкурирующего процесса перераспределения внутренней энергии с изменением спина возбуждённого электрона (интеркомбинационная конверсия). Эффективность данного процесса возрастает в присутствии растворённого кислорода, парамагнитных ионов переходных металлов и т.п. Теперь молекула люминофора может избавится от избытка электронной энергии, испустив вторичный оптический фотон в результате запрещённого (!) излучательного перехода. Этот вид люминесценции называют фосфоресценцией. Длительность свечения при этом возрастает до 10^-4 – 10² с. Спектр фосфоресценции сдвинут в область меньших энергий (больших длин волн) относительно спектра флуоресценции.

Важной с аналитической точки зрения характеристикой люминесценции является квантовый выход. Это один из параметров, влияющих на чувствительность флуориметрического определения. Квантовый выход равен вероятности излучательной релаксации молекул люминофора после фотовозбуждения и принимает значения от нуля до единицы:

где n_погл. и n_исп. – число поглощённых и испущенных фотонов. При альтернативном представлении в знаменателе дроби указано суммарное значение констант скоростей (k_i) всех квантовых процессов с участием молекул люминофора, находящихся на основном колебательном уровне первого возбуждённого электронного состояния. В числителе дроби приведена константа скорости (k_изл.) одного из процессов с испусканием вторичного фотона. При уменьшении температуры раствора люминофора на один градус по Цельсию квантовый выход флуоресценции возрастает на несколько процентов. Начиная с некоторой температуры, он перестаёт меняться, тогда как выход фосфоресценции становится отличным от нуля и быстро увеличивается. При дальнейшем снижении температуры суммарный выход флуоресценции и фосфоресценции стремится к единице.

Снижение квантового выхода называют тушением люминесценции. С увеличением температуры раствора интенсифицируется процесс взаимодействия молекул люминофора и растворителя, сопровождающегося возмущением орбиталей. В этих условиях заметно возрастает вероятность квантового перехода с перераспределением избыточной внутренней энергии. Возбуждённая молекула люминофора за время порядка 10^-9 – 10^-7 с переходит на высокий колебательный уровень основного (!) электронного состояния (внутренняя конверсия). После этого за 10^-13 с она полностью теряет всю избыточную энергию по безызлучательному механизму колебательной релаксации. Описанный выше процесс называют температурным тушением люминесценции. С ростом концентрации люминофора в растворе уменьшается среднее расстояние между его молекулами и увеличивается частота актов межмолекулярного взаимодействия, сопровождающегося прямой безызлучательной передачей избыточной внутренней энергии от одной молекулы к другой, а также образованием нелюминесцирующих молекулярных димеров. Данный процесс, который называют концентрационным тушением люминесценции, ограничивает диапазон определяемых концентраций люминофоров сверху на уровне примерно 10^-4 М.

Зависит ли квантовый выход люминесценции от длины волны первичного и вторичного электромагнитного излучения? Чтобы релаксация возбуждённой молекулы люминофора могла закончиться испусканием оптического фотона, она должна обладать избытком электронной энергии. Конечно, спектр поглощения неоднороден, и фотоны различной энергии поглощаются молекулой люминофора с разной эффективностью. Но если энергия поглощаемых фотонов больше энергии «чистого» электронного перехода, каждый акт поглощения ведёт к увеличению электронной составляющей внутренней энергии. Из правила Каши следует, что эффективность излучательной релаксации никак не связана с энергией возбуждающего излучения, Поэтому квантовый выход не должен значимо меняться при изменении длины волны первичного излучения. Если энергия фотона меньше энергии «чистого» электронного перехода, то доля актов поглощения, сопровождающихся изменением электронной энергии молекулы люминофора, ничтожно мала и определяется заселённостью возбуждённых колебательных уровней основного электронного состояния. При этом с уменьшением энергии фотона (увеличением длины волны) вероятность электронного перехода быстро убывает, поскольку заселённость возбуждённых колебательных уровней экспоненциально падает с ростом их энергии. Таким образом, фотолюминесценция может сохранять постоянный квантовый выход, если возбуждающая волна преобразуется, в среднем, в более длинную, чем она сама. Напротив, выход фотолюминесценции резко уменьшается при обратном превращении длинных волн в короткие (закон Вавилова).

Квантовый выход люминесценции (вероятность излучательной релаксации), интенсивность первичного излучения и молярный коэффициент поглощения (эффективность возбуждения молекул люминофора) входят в качестве параметров в уравнение связи интенсивности люминесценции с концентрацией люминофора (см. описание к работе №11). Данное выражение является основанием количественного флуориметрического анализа.