26. Количественная оценка роста микроорганизмов. Чистые и смешанные культуры микроорганизмов.

Двухфазный рост. У бактерий, способных использовать два различных источника углерода, наблюдают двухфазный рост (так называемая диауксия). Примером может служить рост кишечной палочки на среде с глюкозой и сорбитолом.

• Для подобных микроорганизмов характерен начальный пик роста, в течение которого бактерии утилизируют только один углевод.

• После исчерпания его запасов наступает стационарная фаза, в течение которой в культуре инициируются синтез ферментов и механизмы транспорта для утилизации второго углевода.

• Если физиологические условия удовлетворительны, в бактериальной культуре начинается фаза вторичного экспоненциального роста, инициированная утилизацией второго углевода.

Для выращивания любой культуры необходимы: 1) жизнеспособный посевной материал; 2) источники энергии и углерода; 3) питательные вещества для синтеза биомассы; 4) отсутствие ингибиторов роста; 5) соответствующие физико-химические условия (температура, рН среды, наличие или отсутствие кислорода и др.).

В благоприятных условиях в клетках микроорганизмов начинаются ферментативные процессы, обмен веществ с окружающей средой. Из веществ, проникших в клетку, образуются внутриклеточные вещества и структурные элементы. Одновременно идут процессы распада веществ – диссимиляции. Если анаболические процессы преобладают над катаболическими, наблюдается рост клетки, увеличение ее размеров. Достигнув определенных размеров в соответствующей фазе развития, клетка может начать размножаться.

В результате роста и размножения в питательной среде увеличивается количество клеток. Из-за малых размеров микроорганизмов оценка роста происходит не для индивидуального организма, а для популяции.

В развитии микроорганизмов в несменяемой питательной среде наблюдается несколько фаз. Графическое отражение роста микроорганизмов носит название кривой роста, это необходимо, синтезируются новые ферментные системы. В период лаг-фазы стремительно возрастает количество нуклеиновых кислот, особенно РНК, что необходимо для биосинтеза белков.

После лаг-фазы следует логарифмическая, или экспоненциальная, фаза II, в которой клетки размножаются с максимальной для данной культуры скоростью. Вследствие этого запас необходимых питательных веществ в среде уменьшается, кроме того, происходит накопление различных продуктов обмена веществ, которые в определенной концентрации могут мешать нормальному протеканию биохимических процессов обмена веществ. Иногда в питательной среде накапливается так много клеток, что не хватает пространства, (поверхности для новых поколений клеток). Именно через поверхность происходят процессы обмена – попадание питательных веществ в клетку и выведение метаболитов. Если клетка находится в тесном окружении других клеток, то площадь поверхности уменьшается и вместе с тем снижается интенсивность процессов обмена. Скорость роста культуры также уменьшается, если сокращается поверхность клеток на единицу объема. Это происходит при увеличении размеров клеток и, таким образом, особенно для клеток сферической формы, значительно ухудшаются условия питания.

В ходе интенсивного роста и размножения внутри закрытой системы негативное влияние лимитирующих факторов увеличивается и в результате скорость роста уменьшается, наступает фаза замедленного роста III. Через определенное время в стационарной фазе IV масса клеток в питательной среде достигает максимального уровня, процессы деления и отмирания клеток в популяции находятся в динамическом равновесии. Затем наступает период, когда число отмерших и автолизированных клеток превышает прирост. В результате количество биомассы уменьшается – наступает фаза отмирания V.

Следовательно, наиболее интенсивно рост и размножение происходят в логарифмической фазе, где еще не действуют лимитирующие факторы.

Для характеристики физиологического развития культуры микроорганизмов и используют следующие параметры:

· концентрация клеток (клеток/мл);

· время генерации – промежуток времени, за который число клеток удваивается;

· константа скорости деления – число удвоений в час;

· скорость роста культуры – изменение количества биомассы в единицу времени;

· константа скорости роста.

Количество биомассы можно характеризовать по сухой массе клеток на единицу объема (мг/л, г/л кг/м), в том случае если клетки имеют примерно одинаковые размеры – по числу клеток в единице объема (млн./мл, млрд./мл).

Количественная оценка роста микроорганизмов требует определения числа клеток в конкретный момент. Все эти методы подразделяют на прямые и косвенные. Прямые методы предполагают непосредственный подсчет клеток под микроскопом – в счетных камерах или на фиксированных мазках.

К косвенным методам относятся:

· метод предельного разбавления. При этом методе культуру постепенно разбавляют и определяют, при каком разбавлении не наблюдается ее роста;

· посев на твердые питательные среды;

· центрифугирование или фильтрция культуральной жидкость через мембранный фильтр и дальнейшее высушивание полученной биомассы до постоянной массы;

· нефелометрия, измерение поглощения света клеточной суспензии, что пропорционально числу и размерам клеток;

· определение содержания азота в биомассе, полученной из определенного объема питательной среды;

· определение по интенсивности выделения какого-либо вещества (газа, кислоты и др.).

Оценка роста бактерий Количественную оценку роста обычно проводят в жидких средах, где растущие бактерии образуют гомогенную суспензию. Увеличение количества клеток устанавливают, определяя концентрацию бактерий в 1 мл, либо определяют увеличение клеточной массы в весовых единицах, отнесённых к единице объёма. Подсчёт микроорганизмов можно проводить непосредственно под микроскопом с использованием различных счётных камер (например, Петрова-Хаузера или Горяева). Если толщина слоя среды с микроорганизмами 0,02 мм, а сторона квадрата на предметном стекле 0,05 мм (объём 5-10-8cm3), то количество подсчитанных в квадрате клеток нужно умножить на 2*107, чтобы получить число клеток в 1 мл. Количество живых клеток определяют, подсчитывая выросшие на твёрдой питательной среде бактериальные колонии. При этом учитывают разбавление бактериальной суспензии, сделанное при посеве. Прирост биомассы бактерий оценивают после осаждения центрифугированием известного объёма питательной среды с последующим определением массы осадка (так называемый «сырой вес»). Сухой вес определяют, измеряя массу осадка, высушенного при 100 "С Фотометрические методы измерения мутности бактериальной суспензии основаны на её способности поглощать либо рассеивать свет пропорционально количеству бактерий; эти методы широко применяются на практике. Важно помнить, что линейная зависимость между мутностью суспензии и бактериальной массой наблюдается только при низких плотностях клеточных суспензий. Чтобы правильно измерить количество микроорганизмов в культуре с высокой плотностью, нужно сделать соответствующее разведение образца. Подсчёт с использованием автоматических счётчиков, регистрирующих отрицательный заряд поверхности каждой микробной клетки, основан на снижении проводимости раствора электролита при прохождении одной бактерии через узкое отверстие. Недостаток метода заключается в том, что любая частица (немикробная клетка) или несколько слипшихся частиц дают при подсчёте одинаковый результат. Биохимические методы определения биомассы основаны на определении общего азота в клетках (метод Кьельдаля), общего углерода (по ван Слайку-Фолчу), общего белка (по Лоури или Фолину), поскольку в бактериальной клетке элементный состав довольно стабилен. В тех случаях, когда плотность клеточной суспензии очень мала, можно использовать иные биохимические подходы (например, измерять поглощение кислорода, образование С02 или кислот)   

Чистая культура - культура микроорганизмов, состоящая из клеток одного  вида. Потомство одной клетки (клона). Микроорганизмы одного и того же вида, выращенные в искусственной среде in vitro («в пробирке») и являющиеся потомками одной бактериальной клетки. Своего рода изолированное скопление микроорганизмов, выведенное с помощью посева на питательных средах.

Смешанная культура - культура микроорганизмов, в которой число видов два  и больше. Сообщество бактерий разных видов, первоначально взятое из естественных источников (воздуха, воды, почвы) и культивированное (выращенное) в лабораторных условиях.

Чистая культура. Под чистой культурой понимают потомство одной единственной клетки (клон). Получить чистую культуру, с несомненностью доказать ее чистоту и уберечь от загрязняющих организмов - главная задача микробиолога. Чистые культуры микроорганизмов, за редкими исключениями, выделяют на поверхности или внутри твердой питательной среды. Процедура начинается с отделения от клеточной популяции одной - единственной клетки, причем вырастающая из клетки колония тоже должна оставаться изолированной от других клеток и колоний. Аэробные бактерии выделяют по методу Коха - рассеивают суспензию по поверхности среды в чашках Петри или применяют менее трудоемкий метод - размазывают каплю платиновой петлей по агаризованной среде. Анаэробные бактерии суспендируют в расплавленном агаре (45°С) и проводят инкубацию без доступа воздуха. Тщательное отделение одной колонии, повторное суспендирование в жидкой среде и повторное нанесение штриха или разведение в агаре позволяют получать чистые культуры большинства микроорганизмов.

Смешанные культуры. Естественные популяции, как правило, представляют собой смесь различных микроорганизмов. Между ними существуют самые различные формы взаимодействия; это может быть конкуренция за общий субстрат, комменсализм или мутуализм. Для изучения этих и других форм взаимодействия все чаще используют смешанные культуры. Если создать определенные заданные условия, то как в периодических, так и в непрерывных проточных культурах можно наблюдать последовательную смену (сукцессию) от дельных организмов и накапливаемых продуктов обмена. Это в свою очередь позволяет делать выводы о синэргистических или антагонистических взаимоотношениях между различными организмами. Смешанные культуры могут быть приготовлены путем объединения чистых культур. Исследования, проводимые на смешанных культурах заданного состава, дают возможность понять, какими могут быть сложные формы взаимодействия микроорганизмов в местах их естественного обитания.

Накопительные культуры состоят преимущественно из клеток микроорганизмов одного вида. Элективные (накопительные) условия – условия, способствующие развитию одной культуры и ограничивающие развитие сопутствующих микроорганизмов. 

Чистая культура используется: 1.в научных исследованиях; 2.при диагностике инфекционных заболеваний; 3.как исходный материал для производства вакцин, ферментов, антибиотиков, витаминов, гормонов и др.; 4.в промышленном производстве (молочнокислые закваски, пивные и обычные дрожжи и т.д.).

Смешанная культура дает определение о поведении микробов «в естественной среде». То есть ученые получают возможность проследить за взаимодействием бактерий различного вида, появлением новых свойств, присущих микроорганизмам, только в «сожительстве» с другими видами. В отличие от математических законов в случае со смешанной культурой ее свойства не являются суммой свойств микробов, входящих в нее. Напротив, свойства такой субстанции могут сильно отличаться от характеристик составляющих ее микроорганизмов при их посеве и культивировании в изоляции (чистая культура).

Несмотря на то что выведение чистых культур стало мощным толчком в развитии микробиологии (и до сих пор является ее основным инструментом), смешанные культуры дают более полную картину окружающего мира, так как в природе скопления бактерий одного и того же вида обязательно контактируют с различными микроорганизмами, находящимися по соседству. Особую важность определение смешанной культуры приобретает в медицине, при исследовании взаимодействия различных инфекций с микрофлорой организма. То есть определение заболевания основано на выведении чистых культур, а для полного изучения болезни в развитии необходимо исследовать смешанные культуры

Для выведения чистой культуры существует несколько различных методов:

1. Метод Луи Пастера (французский химик, один из основоположников микробиологии). Суть метода в последовательном разведении изучаемого образца в жидкости (в пробирке) до получения единичной клетки в заданном объеме. Этот метод интересен скорее в историческом, чем в практическом плане.

2. Метод Роберта Коха (немецкий микробиолог). При этом способе исследования материал разводят в агар-агаре (при t⁰ 48-50), который затем разливают по чашкам Петри и дают застыть. Для посева (разлива) используют несколько последних разведенных образцов, где количество клеток значительно меньше. В дальнейшем это облегчает определение в глубине агар-агара и перенос колоний (скопление микробов, выросшее из единичной клетки) на другие питательные среды для непосредственного выведения чистой культуры.

3. Метод Дригальского (немецкий исследователь). Пожалуй, самый распространенный вариант исследования. Метод состоит в том, что материал для анализа разводят в пробирке физраствором или бульоном, затем единственную каплю из пробирки переносят в чашку Петри (делают посев) и распределяют шпателем. Затем, не меняя и не стерилизуя шпатель, делают посевы поочередно в двух и более чашках. В последнем посеве на шпателе остается минимальное количество бактерий. Появляется высокая вероятность, что единичная клетка будет изолирована и на питательной среде разрастется в колонию бактерий одного вида.

Кроме этих, есть еще несколько специальных методов, применяемых для микроорганизмов, гибнущих на открытом воздухе или проводимых с помощью современной высокоточной техники. Выделенные культуры бактерий одного и того же вида тщательно консервируют (высушивают, изолируют от атмосферы, подвергают заморозке и т. д.) и хранят в соответствии с инструкциями.

Концентрация бактерий – число клеток на 1 мл.  Плотность бактерий – мг/мл.  Константа скорости деления клеток – число удвоения концентрации  бактерий за 1 ч .  Время генерации – время удвоения числа клеток.