Правила роботи під час фракціонування клітин

Більшість досліджень у фізіології і біохімії проводять на клітинному або субклітинному рівнях. Експериментальним матеріалом є клітини, взяті з організму тварин. Попереднє оброблення цього біологічного матеріалу полягає у фракціонуванні клітин, що складається з двох послідовних етапів – гомогенізації і розділення. Метою гомогенізації є руйнування тканин, клітинних мембран і вивільнення клітинного вмісту – отримання гомогенату. Найчастіше для гомогенізації тваринних тканин використовують гомогенізатор з механічним приводом поршня (гомогенізатор Понтера-Ельвегейма), який обертається і одночасно рухається вниз-вверх у скляному циліндрі. Сам поршень виготовляють із скла, що передбачає жорстке гомогенізування і не забруднює тканину сторонніми речовинами. Підбираючи час гомогенізації, швидкість руху і обертання поршня та щілину між ним і стінкою циліндра, можна досягти того, що внутрішньоклітинні органели, як ядро чи мітохондрії практично не будуть ушкоджені. Руйнування клітин, як і тертя поршня до стінок циліндра, супроводжується виділенням тепла. Багато ферментів за високих температур інактивуються, тому гомогенізацію доцільніше здійснювати за допомогою тефлонового гомогенізатора, охолоджуючи стінки циліндра до температури від 0 до +4°С.

Щоб зберегти нативну структуру і функціональну активність органел, важливе значення для гомогенізації має правильно підібране рН, іонний та осмотичний склад розчину.

Працюючи з добре притертим гомогенізатором, не можна швидко піднімати поршень з крайнього нижнього положення, оскільки під ним у циліндрі виникне досить сильне розрідження, внаслідок чого поршень, злетівши із тримача механічного приводу, з силою вдариться об дно і може видавити його. Не можна користуватися гомогенізатором, стінки якого мають тріщини.

На другій стадії фракціонування – розділенні – відбувається групування окремих компонентів гомогенату за такими фізичними властивостями , як розмір і густина. Для розділення у фізіологічних і біохімічних дослідженнях використовують центрифугування.

Основною частиною центрифуги є ротор, який обертається з великою швидкістю навколо своєї осі, завдяки чому створюється відцентрова сила. Під дією відцентрової сили завислі у рідині частинки відкидаються від центру і тим самим відокремлюються від рідини. Відцентрова сила є пропорційною радіусу ротора центрифуги (від осі обертання до відповідної точки) і квадрату частоти його обертання.

Найчастіше використовують механічні закриті центрифуги з частотою обертання ротора від 1000 до 3000 об⁄хв без охолодження, чи з ним (рефрижераторні центрифуги). Пробірок, які одночасно ставлять у центрифугу, має бути парна кількість. Протилежно розміщені пробірки у центрифузі після наповнення рідиною мусять мати однакову масу. Щоб зрівноважити їх, використовують спеціальні ваги. Відстань від краю пробірки до рівня рідини має становити не менше 10 мм.

Ротор центрифуги не відразу виходить на задану частоту – для настільних центрифуг час досягнення стабільного режиму може становити 5 хв. Потужні центрифуги запускають плавно, тому час досягнення стабільного режиму у них може бути ще більшим.

Після вимкнення центрифуги чекають, поки вона сама не зупиниться, і тільки тоді виймають пробірки та зливають чисту надосадову рідину з осаду.

За центрифугою потрібно постійно доглядати, не допускаючи забруднення. Перед використанням центрифуги перевіряють її заземлення. Запускають центрифугу лише тоді, коли протилежно розміщені пробірки є зрівноваженими, а кришка закритою. Відкривають кришку центрифуги лише після повної зупинки ротора. Не змінюють частоту обертання, не відімкнувши центрифугу від електромережі. Категорично заборонено використовувати нестандартні пробірки і нестандартні плавкі запобіжники.