44.Цитогенетические методы (классические и современные): возможности и этапы. Показания для использования цитогенетических методов.

-метод основан на изучении генетики ядра и внутриклеточных органов (митохондрий в кл животного происх-я). Метод анализа хромосом

В основе лежит кареологический анализ результатом ко-го является составление идеограмм.

Позволяет выявить отклонения в структуре и числе хромосом (метод исследования кариотипа), т.е. диагностика хромосомных синдромов.

Объект- культуры лимфоцитов периферической крови, фибробластов кожи

Определяется наличие Х и У полового хроматина- половая принадлежность.

Методы исследования кариотипа:

1.Класический (используют лейкоциты)

2.Современные, молеклярные цитоген-е методы

3.тест полового хроматина (если есть глыбка-жен)

Применяют для:

1.предварит-я диагно-ка пола

2.пред-я диагностика хр-х син-м, связ-х с изменением числа половых хромосом (с-м Клаинфельтера 47ХХУ, Трипло-Х 47,ХХХ, Шерешевского-тернера 45,Х)

3.судмедэкспертиза

4.Гендорный/половой тест в большом спорте

Алгоритм:

1.отбор материала кариотипирования- лейкоциты переф-й крови или др кл с выс митотической активностью

2.культивирование лейкоцитов на пит ср (термостат 37С)

3.добав-е в культурную ср ФГА для стимуляции деления лейкоцитов

4.остановка митозов на стадии метафазы добав-м колхицина

5.приготовление микропрепаратов метафазных хромосом

• Растировка культуры на предметном стекле

• обработка препаратов гипотоническим раствором с целью получения препар-в с раздельно лежащими хромосомами

• Окрашивание (а)методика рутинного окрашивания-диагностика геномных мутаций, б)методика дифференц-го окрашивания-диагностика аберрации)

6.микроскопирование препаратов и фотографирование кариотипов

7. составление идиограм

8.идентификация полученных идиограм с денверской и парежской класс-ии

9.Заключение по результатам кариологического анализа.

Показания к применению метода с целью диагностики хромосомных мутаций:

1) МВПР у ребенка

2) олигофрения в сочетании с комплексом микроанамалий

3)Гипогенетализм, задержка полового созревания, первичная аменорея, бесплодие

4)Повт-е спонтанные аборты на ранних сроках беременности, мертворождения

5)Высокий риск- жен 35, наличие в семье ребенка с хромосомным синдромом

6)диагностика хр-х синд-в

7)диагностика пола

8)Перефикация онкодиагноза и контроль за лечением

9)опр-е мутогенного возде-я фак-в окр ср

45. Прямая и косвенная ДНК-диагностика: особенности проведения и границы применения.  Прямая ДНК-диагностика: заключается в обнаружении конкретных повреждений в известном гене. При этом положительная черта метода – практически 100% точность. Однако, чтобы провести прямую ДНК-диагностику, необходимо знать ген  Косвенная ДНК-диагностика: применяется, когда мутантный ген еще не установлен, но точно картирован на хромосоме. С помощью сцепленных с данным хромосомным участком маркеров в ряду поколений анализируется наследование хромосомы, несущий патологический ген. Недостаток: 1-5% ошибок в диагностике, необходимо привлекать для обследования больного его родственника

Прямая ДНК-диагностика включает непосредственное выявление му¬тации в  исследуемом гене. Практически она является абсолютно точной, требует для  анализа лишь образец ДНК обследуемого лица и может про¬водиться как в  семейных, так и в спорадических случаях заболеваний. Для проведения  прямой ДНК-диагностики необходимо точно знать структуру соответствующего  гена или конкретной его содержащей мутацию частицы, которая  анализируется. Теперь большинство протоколов прямой ДНК-диагностики  базируется на полимеразной цепной реакции, которая позво¬ляет в течение  нескольких часов получить достаточное для анализа количе¬ство копий  фрагмента изучаемого гена.  Ковеная-Это метод ДНК-диагностики основанный на анализе сцепления с исследуемым геном определенного полиморфного локуса (маркера), с помощью которого можно производить маркировку как мутантных, так и нормальных аллелей и проанализировать их передачу в поколениях. Для косвенной ДНК диагностики необходимо знать точную локализацию гена, т. е. ген должен быть достаточно точно картирован. Сущность заключается в анализе наследования полиморфных генетических маркеров сцепленных с геном болезни.  Косвенная ДНК-диагностика возможна в случае если ген заболевания достаточно хорошо картирован, применяется для определения генетического статуса лиц в семье, отягощенной наследственными заболеваниями, если непосредственное определение мутаций в анализируемом гене невозможно или затруднено.  Недостатки.  1. Требуется анализ ДНК нескольких членов семьи, как правило, из 2-3 поколений.  2. Для проведения косвенной ДНК-диагностики у лиц из группы риска необходимо предварительно диагностировать заболевание хотя бы у одного индивида в родословной; т.е. этот метод неприменим для диагностики спорадических случаев  3. Всегда существует вероятность ошибки(1-3%), связанная с возможной рекомбинацией в мейозе между геном болезни и исследуемым маркёром.  Методы:Анализ наследования полиморфных генетических маркеров сцепленных с геном болезни, Анализ ПДРФ (Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов), основанный на использовании сцепленных с геном болезни полиморфных сайтов рестрикции.