Методы выделения и очистки белков.
Последовательность операций по выделению белков:
-
измельчение биологического материала (гомогенизация);
-
перевод белков в растворенное состояние – экстракция;
-
выделение исследуемого белка из смеси других белков, т.е. очистка и получение индивидуального белка.
Различают качественный и количественный анализ белков в растворах. Явление денатурации применяют для качественного анализа присутствия белков в растворах. Для этого пробу с исследуемой жидкостью кипятят после её подкисления. Образующееся при этом помутнение связано с денатурацией белка. Часто используют осаждение органическими кислотами: сульфосалициловой и трихлоруксусной. Для количественного анализа белков определяют белковый азот. Для этого пробу сжигают при высокой температуре в присутствии Н2SО4 и перекиси водорода (окислитель). Происходит минерализация, при этом азот в форме аммиака связывается с серной кислотой (сульфат аммония). Количество сульфата аммония определяют или реактивом Несслера, или после перегонки аммиака титрометрически. Значительно чаще для количественного определения используют цветные реакции (биуретовая или реакция на фенольные группы – метод Лоури). Биуретовая реакция основана на том, что в щелочной среде ионы меди реагируют с пептидными группировками, образуя комплексные соединения, окрашенные в фиолетовый цвет. Интенсивность окраски фотометрируется. Сочетание биуретовой реакции и реакции на фенольные группировки используется в методе Лоури. Для количественного определения индивидуальных белков в их сложных смесях популярны иммунологические методы. При взаимодействии белка со специфической антисывороткой образуется мутный раствор. Интенсивность помутнения может быть измерена колориметрическими методами или методами, применяемыми в иммунологии.
Таким образом, к методам выделения и очистки белков относят: электрофорез, высаливание, денатурацию, количественный анализ и фракционирование.
Фракционирование белков связано с высаливанием и заключается в том, что комбинируя разные концентрации солей и спирта или ацетона, действующих при непродолжительном контакте с белками подобно солям щелочноземельных металлов, белки плазмы крови разделяют на ряд фракций, которые затем используют для получения чистых белковых препаратов. Высаливание не вызывает нарушений структуры белков, поэтому после удаления солей эти препараты сохраняют свое биологическое действие. Но спирт или ацетон можно использовать только при низких температурах (-20ºС).
Лекция № 9. Тема «химия нуклеиновых кислот».
-
Нуклеопротеины – состав, биологическое и клиническое значение.
-
ДНК и РНК – их состав, виды, уровни организации, биохимические свойства.
-
Нуклеотиды и нуклеозиды. Номенклатура, строение.
-
Нуклеотиды, не входящие в состав нуклеиновых кислот, их биологическая роль (АТФ, АДФ как основные представители макроэргов, циклические мононуклеотиды; КоА, НАД, НАДФ, ФАД, ФМН – схема строения молекул и биохимическое значение).
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ – это высокомолекулярные органические соединения, которые при гидролизе распадаются на пуриновые и пиримидиновые основания, пентозу и фосфорную кислоту. Говоря об элементарном составе, необходимо отметить, что в их состав входят фосфор – 8-10%, азот – 15-16%, а также углерод, кислород и водород. В настоящее время установлено, что нуклеопротеиды являются не только структурными элементами клетки, но и играют важную биологическую роль. С нуклеопротеидами и нуклеиновыми кислотами связаны биосинтез белков, хранение и передача наследственной информации, разнообразные коферментные функции.
Нуклеиновые кислоты впервые были получены в свободном от белка состоянии Ф. Мишером (1868 г.) из животных тканей и дрожжей, а в 1936 г. Белозерским А.Н. и его сотрудниками – из растительного материала. Как и белки, нуклеиновые кислоты состоят из мономеров – мононуклеотидов, которые, соединяясь друг с другом, формируют цепи полинуклеотидов – нуклеиновых кислот. Большая часть нуклеиновых кислот связана с белками, образуя нуклеопротеины, которые расположены в разных частях клетки.
С
гуанин
цитозин
урацил
тимин
Дезоксирибонуклеопротеины
(ДНП) сосредоточены главным образом в
ядре клетки и в очень небольшом количестве
встречаются в цитоплазме (митохондриях,
хлоропластах), а рибонуклеопротеины
(РНП) выполняют свои функции в цитоплазме,
и только небольшая часть входит в состав
ядра (ядрышки).
Мононуклеотиды являются участниками обмена энергии в клетке, участвуют в действии гормонов на клетки.
Азотистые основания – это гетероциклические соединения с основными свойствами, разделяются на две группы: пуриновые (аденин, гуанин) и пиримидиновые (тимин, цитозин, урацил).
Соединение основания и пентозы носит название нуклеозид. Остаток фосфорной кислоты присоединяется к гидроксильным группам пентозы. К одному атому пентозы могут присоединяться от одного до трех остатков фосфорной кислоты. Название мононуклеотида состоит из названия нуклеозида, указания места присоединения и количества остатков фосфорной кислоты. Название нуклеозида определяется содержащимся в нем азотистым основанием. Название рибонуклеозидов пуринового ряда имеет характерное окончание «-озин», а пиримидинового ряда «-идин».
Например: аденин + рибоза → аденозин
нуклеозид
Если к этому нуклеозиду присоединить остаток фосфорной кислоты в положении 5′, то такой мононуклеотид называется аденозин-5′-монофосфорная кислота, или аденозин-5′-монофосфат (АМФ). Если к тому же атому пентозы присоединить еще один остаток фосфорной кислоты, то соответственно образуется аденозин-5′-дифосфорная кислота, или аденозиндифосфат (АДФ), и добавление третьего остатка приведет к образованию аденозин-5′-трифосфорной кислоты, или аденозинтрифосфата (АТФ).
Соединения, в которых изменения свободной энергии реакции гидролиза превышают значения 40 кДж/моль, получили название макроэргов. Макроэргические связи в таких соединениях обозначаются значком «~».
Сумма адениловых нуклеотидов АТФ, АДФ, АМФ обозначается как адениловая система и широко используется в клетке как основная сопрягающая система между окислительными реакциями, производящими энергию, и процессами, потребляющими энергию.