Лекция № 7. Тема «химия белка».

1. Изопротеины, их биологическое и клиническое значение.

2. Физико-химические свойства белков.

3. Конформация белков, её биологическое значение:

- специфическое белок-лиганд взаимодействие;

- кооперативный эффект;

- факторы регуляции.

4. Классификация белков. Простые белки: представители, биологическое значение.

Белки с одинаковыми функциями, но отличающиеся физико-химическими свойствами, получили название – изопротеины. Так, например, фермент-белок лактатдегидрогеназа (ЛДГ), состоит из 4-х субъединиц, формируется из 2-х генетически детерминированных полипептидных цепей «Н» и «М». Их разные комбинации позволяют создать 5 ферментов-белков, катализирующих одинаковую реакцию в разных органах и тканях. Это имеет важное значение для диагностики различных заболеваний.

Размер молекул белка, растворимость, электрический заряд и другие физико-химические свойства их в большой мере определяют биологическую роль белков, их участие в процессах обмена веществ, а также в формировании структуры и функций организма.

Белки как коллоиды. Белки в организме находятся в коллоидном состоянии. При определенных условиях можно получить и кристаллические формы белков. Имея большой размер молекулы – 0,001-0,1 мкм, белки не проходят через полупроницаемые перегородки, какими являются клеточные мембраны. Этим пользуются для очистки растворов белка от остатков низкомолекулярных веществ (солей, сахаров) при изготовлении иммунных сывороток, сухой плазмы, γ-глобулина и других препаратов. Метод такой очистки белков получил название – диализ. Для растворов белков характерен оптический эффект Тиндаля (при пропускании пучка света через коллоидный раствор путь луча имеет вид светящегося конуса – см. рисунок 21, уч. Ермолаев. Биохимия, стр. 42) – это явление используется для определения белка методом нефелометрии. Явление диализа лежит в основе действия аппарата «искусственная почка», который широко используется в клиниках для лечения почечной недостаточности. Для коллоидных растворов характерна способность преломлять луч света, что используется для количественного определения белка методом рефрактометрии.

Молекулярная масса белков. Молекулярная масса белков колеблется от нескольких тысяч до миллионов. Размеры молекул отдельных белков могут приближаться к размерам наименьших живых существ.

Точность определения молекулярной массы белков зависит от метода и условий, в которых определяется эта масса, в частности, от реакции среды. Одной из характерных особенностей многих белков является их свойство образовывать молекулярные агрегаты, состоящие из нескольких молекул. При изменении температуры, величины рН, добавлении некоторых органических и минеральных веществ способность белков к агрегации или диссоциации на субъединицы изменяется. Это обусловливает изменение величины молекулярной массы белков и в определенной мере влияет на результаты изучения молекулярной массы.

Белки – амфотерные электролиты. Благодаря наличию в белках аминных и карбоксильных групп, они в кислой среде диссоциируют как основания, а в щелочной – как кислоты. Ионное состояние белков в большой мере обусловливает их физико-химические свойства. Так, вязкость, онкотическое давление, способность к набуханию зависят от степени диссоциации белков. Амфотерные свойства белков обусловливают их значение как буферных систем, поддерживающих постоянство реакции среды в тканях, их участие в регуляции рН крови.

Амфотерность белков используют для разделения их на фракции с целью диагностики ряда заболеваний и контроля за состоянием больного, так как при различных патологических состояниях фракционный состав белков существенно меняется.

Изоэлектрическое состояние белка. Свойства белков определяются свойствами аминокислот, из которых состоят белки. Аминокислоты – амфотерные соединения, и это их свойство обусловлено амино- и карбоксильными группами. Число таких групп зависит от числа основных и кислых аминокислот в белковой молекуле. Все эти группы в белке находятся в ионизированном состоянии в зависимости от рН. Белки также при определенном значении рН имеют нейтральный заряд, такое значение рН называют изоэлектрической точкой белка (рJ). При этом белок находится в наименее устойчивом состоянии. При рН ниже рJ увеличивается число положительных зарядов и молекула белка становится катионом. При рН выше рJ увеличивается число отрицательных зарядов и белок становится анионом. рJ большинства природных белков находятся в пределах рН 4,8 – 5,4, что свидетельствует о преобладании в их составе дикарбоновых кислот. Значение рJ белка важно для разделения белков методом электрофореза, который занимает а лабораторной практике важное место.

Все несущие заряд частицы передвигаются в электрическом поле в зависимости от величины заряда. Постоянное электрическое поле можно получить, используя источники постоянного напряжения и пропуская постоянный ток через буферный раствор. Выбирая рН буферного раствора, можно управлять характером распределения белков в электрическом поле. Скорость перемещения молекул зависит от ряда факторов: присутствия других ионов, температуры, молекулы носителя, на котором проводится разделение, величины заряда самой белковой молекулы. Метод разделения, учитывающий все указанные факторы называется электрофорезом. Его применяют как для разделения белков, так и любых частиц, имеющих заряд.

Вначале разделение белков проводили в буферном растворе (электрофорез со свободной границей), а затем большое распространение получил электрофорез на носителях. Носителем служат полоски бумаги, ацетатцеллюлозы, агаровый, крахмальный, полиакриламидный гель, смоченные или содержащие буферный раствор. В клинической практике наибольшую популярность приобрел электрофорез на ацетатцеллюлозных полосках для разделения белков плазмы крови. Обычно белки плазмы в стандартных условиях электрофореза (буферный раствор рН 8,8) разделяются на 5 фракций. Полоски пропитывают красителем, который количественно связывается с белками, что позволяет после извлечения краски количественно оценить элекрофореграмму. Соотношение между отдельными фракциями меняется при разных заболеваниях. Для определения индивидуальных белков пользуются сочетанием электрофореза с иммунологическими реакциями (иммуноэлектрофорез).

Гидрофильность и гидрофобность белков. Белки обладают большим сродством к воде, т.е. вокруг белковой молекулы расположена гидратная оболочка, предохраняющая от склеивания и выпадения в осадок. Величина гидратной оболочки зависит от структуры белка. Альбумины связываются с молекулами воды и имеют большую водную оболочку, а глобулины, фибриноген присоединяет воду хуже и гидратная оболочка у них меньше.

Таким образом, устойчивость водного раствора белка определяется двумя факторами:

1. наличием электрического заряда белковой молекулы;

2. находящаяся вокруг молекулы водная оболочка.

При удалении этих факторов белок выпадает в осадок.

Адсорбция – способность поглощать на своей поверхности некоторые вещества и ионы (гормоны, витамины, железо, медь и др.), которые либо плохо растворимы в воде, либо являются токсичными (билирубин, свободные жирные кислоты). Белки транспортируют их по крови к местам дальнейших превращений или обезвреживания.

Осаждение белков.

а) обратимое – (высаливание) путем добавления солей щелочноземельных металлов. В основе действия лежит конкуренция их с белками за воду. Высаливающий эффект наступает при достаточно высоких концентрациях солей (насыщенные или полунасыщенные растворы). В практике часто используют Nа₂SО₄ и (NН₄)₂SО₄. эти соли удаляют водную оболочку и снимают заряд. Глобулины, имеющие крупные и тяжелые молекулы и небольшую водную оболочку, выпадают в осадок при неполном насыщении раствора солями, а альбумины как более мелкие молекулы, окруженные большой водной оболочкой – при полном насыщении.

После удаления солей, белок возвращается в нативное состояние.

б) необратимое осаждение связано с нарушением пространственной структуры, что приводит к потере свойств. Это денатурация (в желудке, ожоги, свертывание крови и др.). денатурацию могут вызывать факторы: нагревание, облучение, механическое встряхивание, охлаждение, химическое воздействие – действие кислот и щелочей, ионов тяжелых металлов и др. Белки имеют высокую чувствительность к повышению температуры, поэтому термостабильность для белков не характерна. Денатурация – процесс разрушения пространственной структуры путем разрыва дисульфидных и слабых нековалентных связей. При этом происходит развертывание цепей и утрата биологической активности без разрушения пептидных связей, т.е. первичная структура белка сохраняется. Реакции осаждения белков используются в медицине для выделения и обнаружения белка в крови, моче. В лабораторной практике денатурация используется для депротеинизации биологических жидкостей.

Денатурация белков положена в основу лечения отравлений тяжелыми металлами, когда больному per os вводят молоко или сырые яйца с тем, чтобы Ме, денатурируя белки молока и яиц, адсорбировали их на поверхности Ме и не действовали на белки слизистой оболочки желудка и кишечника, а также не всасывались в кровь.

Конформация белков – это пространственное расположение в молекуле белка замещающих групп, способных свободно изменять своё положение в пространстве без разрыва каких-либо связей, благодаря свободному вращению вокруг одинарных углерод-углеродных связей.

В природе полипептидная цепь нативного белка имеет одну или очень ограниченное число конформаций. Эта нативная конформация является устойчивой и формирует её связи, делающие стабильной третичную структуру белка, которая называется нативной конформацией.

Основным свойством белка, обеспечивающим его функцию, является избирательное взаимодействие с определенным веществом – лигандом. Лигандами могут быть вещества разной природы, как низкомолекулярные, так и макромолекулы, в том числе белки. На белковых молекулах есть участки, центры связывания или активные центры, к которым присоединяется лиганд. Связи между белком и лигандом могут быть нековалентными и ковалентными. Высокая специфичность взаимодействия белка и лиганда обеспечивается комплементарностью структуры активного центра пространственной структуре лиганда.

Белок-лигандное взаимодействие описывается уравнением:

Р + L ↔ РL

белок лиганд белково-лигандный комплекс

К_дисс. – константа диссоциации комплекса

Из равновесия реакции следует, что если [Р] = [РL], то К_дисс.= [L]. Равенство [Р] и [РL] наступает при полунасыщении белка лигандом, т.е. 50% молекул белка связаны с лигандом , а 50% свободны. Максимальная величина РL означает, что весь белок связан с лигандом.

Четвертичная структура характерна для белков, состоящих из нескольких субъединиц и представляет собой взаиморасположение их в пространстве. Каждая из субъединиц несет часть функциональной активности. Например, молекула гемоглобина состоит из 4-х субъединиц, каждая из которых способна присоединять молекулу кислорода. При этом связывание кислорода одной субъединицей так изменяет конформацию остальных, что присоединение кислорода к ним облегчается, т.е. увеличивается их сродство к кислороду. Это так называемый кооперативный эффект.

К факторам регуляции, влияющим на конформацию белка относятся: а) неспецифические факторы регуляции – изменение рН, температуры, которые в равной мере влияют одновременно на все белки; б) специальные специфические факторы регуляции.

В основе классификации белков лежат их химические и физические свойства, а также биологическая роль, которую они выполняют в организме.. все белковые вещества разделяются на 2 большие группы: простые белки – протеины и сложные – протеиды. По форме белковой молекулы белки делятся на глобулярные (шаровидные) и фибриллярные (нитевидные). По растворимости в воде выделяют водорастворимые, солерастворимые, нерастворимые в воде (характерны для биологических мембран).

Водорастворимые простые белки имеют глобулярную форму. Они находятся в биологических жидкостях, выполняют транспортные функции, являются ферментами и т.д.

Водонерастворимые простые белки имеют форму нитей. Это фибриллярные белки. Они выделены из кожи, костей, сухожилий и др. Типичный белок такого типа – коллаген.

Простые белки при гидролизе образуют только аминокислоты. Простые белки разделяются на альбумины и глобулины, протамины и гистоны и др.

Альбумины – в крови, спинномозговой жидкости, а также в клетках всех животных, растений и микроорганизмов. Хорошо растворимы в воде, отличаются от глобулинов незначительным содержанием глицина. Содержат много серусодержащих аминокислот. Альбумины – мелкодисперсные молекулы, окружены большой водной оболочкой, легко вступают в связь с различными веществами с образованием комплексов (альбумин-билирубиновый и др.). Обеспечивают кислотные свойства. Альбумины участвуют в поддержании осмотического давления крови (создают онкотическое давлении), транспортируют с кровью различные вещества.

Глобулины – почти всегда встречаются вместе с альбуминами. Они растворимы в воде и легко растворяются в солевых растворах слабой концентрации. В альбуминах находится лейцин (до 15%) и очень мало глицина. В глобулинах больше глицина, находятся в более грубодисперсном состоянии, чем альбумины. Их можно разделить на α-, β-, γ-глобулины. Глобулины входят в состав ферментов, составляют основу иммуноглобулинов, выполняющих функции антител. Глобулины плазмы крови выполняют транспортную роль.

Гистоны у человека в свободном состоянии не встречаются. В их составе преобладают остатки диаминомонокарбоновых кислот (аргинина, лизина) и гистидина. Эти белки имеют резко основной характер. Представитель – глобин, который входит в состав гемоглобина. Гистоны встречаются в значительных количествах в белках эритроцитов и зобной железы.

Протамины – белки, включающие до 80% диаминомонокарбоновых кислот. У них ещё более ярко выражены основные свойства по сравнению с гистонами. Высоким содержанием протаминов отличаются сперма и икра рыб, а также многоядерные ткани. Протамины и гистоны составляют белковую часть нуклеопротеидов, поэтому представляют значительный биологический интерес.