5. Одержання інсуліну

Одним із практично важливих для медицини білків, одержання якого доцільно проводити мікробіологічним шляхом, є інсулін людини — гормон підшлункової залози, що регулює процеси вуглеводневого обміну і підтримання нормального рівня цукру в крові. Цей невеликий глобулярний білок, що містить 51 амінокислотний залишок, складається з двох поліпептидних ланцюгів (А- і В- ланцюги), що зв'язані між собою двома дисульфідними містками. Він синтезується на рибосомах у вигляді одноланцюгового попередника — препроінсуліну, що містить N-кінцевий сигнальний пептид і 35-ланковий з'єднувальний пептид (С-пептид). У клітині при видаленні сигнального пептиду генерується проінсулін, що складається з 86 амінокислотних залишків, у якому С-пептид з'єднує А- і В-ланцюги інсуліну і забезпечує їх необхідну орієнтацію при замиканні дисульфідних зв'язків. Після протеолітичного відщеплення С-пептиду продукується інсулін.

Недостатня кількість цього гормону в організмі призводить до однієї із найтяжчих хвороб — цукрового діабету. Згідно статистичних даних, у світі понад 60 млн. чоловік страждає від цього захворювання, яке, як причина смерті, стоїть на третьому місці після серцево-судинних захворювань і раку. Один із ефективних методів лікування діабету заснований на принципі компенсації порушеного метаболізму шляхом ін'єкції хворому інсуліну тваринного походження, найчастіше виділеного із підшлункової залози телят і свиней. Однак частина хворих, особливо діти, часто алергенні до гетерологічного гормону, що ускладнює їх лікування. Крім того, у зв'язку зі збільшенням числа інсулін-залежних хворих, препаратів, що одержуються з домашніх тварин, стало не вистачати. Тому і виникла необхідність у виробництві бактеріально продукованого інсуліну людини.

Роботи по генно-інженерному одержанню інсуліну розпочалися порівняно недавно і розвивалися швидкими темпами. У 1978 p. у США з'явилось повідомлення про одержання штаму Е. соlі, що продукує червоний проінсулін. У тому ж році співробітниками американської фірми «Genentech» спільно з науково-дослідною групою медичного центру «City of Hope» було оголошено про закінчення робіт по синтезу окремих А і В ланцюгів інсуліну людини шляхом експресії їх синтетичних генів у клітинах Е. coli.

Нуклеотидна послідовність цих генів була виведена штучно на основі відомої амінокислотної послідовності інсуліну і генетичного коду з урахуванням частоти використання різних кодонів у бактеріальній ДНК. Кожен із одержаних синтетичних (хіміко-ферментативним способом) полінуклеотидів окремо з’єднувався з 3'-кінцем гену білка -галактозидази і вводився у векторну плазміду. Клітини, трансформовані такими рекомбінантними плазмідами, продукували химерні білки, що складалися із більшої частини β-галактозидази і А- чи В-пептиду інсуліну, приєднаного до неї через залишок метіоніну. При обробці химерного білку бромціаном, що специфічно розщеплює білки за залишками метіоніну, звільнявся пептид, що відповідав А- чи В-сегменту (у складі яких немає метіоніну). Згідно попередніх повідомлень, специфічне замикання дисульфідних містків між синтетичними ланцюгами А і В інсуліну проходило з невисоким виходом і активний гормон можна було виявити тільки радіоімунологічними методами.

Враховуючи, що інсулін утворюється з більш високим виходом (до 70%) із свого біосинтетичного попередника проінсуліну, у ряді лабораторій було розпочато дослідження по одержанню генів людського проінсуліну і його функціонально подібних аналогів. Паралельно з цим продовжувались роботи по підвищенню виходу активного гормону із окремих ланцюгів. Так, у 1981 p. було синтезовано ген аналога проінсуліну — міні-С-проінсуліну, у якому 35-ланцюговий С-пепдид замінено на сегмент із 6 амінокислот Arg—Arg—Gly—Ser—Lys—Arg і показана його експресія в Е. coli. При цьому автори роботи виходили із припущення, зробленого на основі даних рентгеноструктурного аналізу, що такого невеликого з'єднувального пептиду буде достатньо для забезпечення просторового складання А- і В-ланцюгів. Міні-С-проінсулін синтезувався в бактеріальних клітинах приєднаним до лідерного білка і відділявся від одержаного таким чином химерного білка у результаті обробки виділеної із бактерій білкової фракції бромціаном. Однак із приведених в літературі даних слідує, що задовільних результатів по конверсії міні-проінсуліну в інсулін одержано не було.

У 1980 p. в США із тканин людини була виділена мРНК інсуліну, шляхом зворотної транскрипції з неї була синтезована кДНК і клоновано ген проінсуліну людини. Поряд з цим у Канаді було здійснено повний хіміко-ферментативний синтез гена проінсуліну.

Подібні дослідження проводилися свого часу і в СРСР, в Інституті біоорганічної хімії ім. М. М. Шемякіна АН СРСР. Серед кількох можливих шляхів, за допомогою яких можна одержати еукаріотичний ген і експресувати його в прокаріотах, у даному випадку було вибрано хіміко-ферментативний синтез. Цей підхід має ряд переваг. По-перше, з його допомогою можна безпосередньо одержати необхідну послідовність ДНК, причому її кодуюча частина і некодуючі ділянки можуть бути спроектовані з урахуванням експресії в різноманітних організмах, містити в певних місцях сайти упізнавання різноманітними ендонуклеазами рестрикції і т. д. По-друге, хімічний синтез виключає найбільш складну частину роботи при одержанні гена із природного джерела — виділення відповідної мРНК чи геномної ДНК. По-третє, він спрощує модифікацію гена і білку, що з нього одержується. Останні успіхи досягнуті у розробці нових методів синтезу оліго- і полінуклеотидів, у поєднанні з технологією рекомбінантних ДНК зробили цей підхід особливо ефективним у тих випадках, коли цільовий фрагмент ДНК відносно невеликий (до 300 — 400 нуклеотидних залишків).

Нуклеотидна послідовність гена проінсуліну людини була виведена виходячи із структури (частоти триплетів нуклеотидів) гена проінсуліну пацюка. Для цього 14 кодонів гена пацюка було замінено триплетами, що відповідають амінокислотам, які входять до складу проінсуліну людини. Причому із кількох можливих варіантів заміни вибрано той, який призводив до мінімальних відмінностей від структури гену пацюка і дозволяв максимально зберегти особливості еукаріотичних генів. Загальна конструкція гена передбачала також проведення його клонування і експрессії у складі бактеріальної плазміди. Так, у структуру синтетичного полінуклеотиду, окрім триплетів, що кодують амінокислоти проінсуліну, було введено кодони ініціації і термінації, трансляції, а також «липкі кінці» для введення гена у векторну молекулу. Як один із варіантів було передбачено модифікацію 5'-кінцевої частини гена. Між метіоніновим кодоном і виступаючим тетрануклеотидним кінцем, що генерується ендонуклеазою рестрикції E. coli, було добавлено 15-ланковий фрагмент, який кодує ділянку зв'язування рибосоми. Другий варіант синтетичного гена, що не містить цієї послідовності, розрахований на експресію за допомогою генетичних регуляторних елементів, що містять промотор і послідовність Шайн - Дальгарно. Зокрема, оскільки проінсулін не містить залишків метіоніну, можна використовувати промотор і проксимальну частину гена якого-небудь білку, наприклад β-галактозидази Е. coli, тоді як перший варіант гена передбачає використання з цією метою фрагментів ДНК, що несуть тільки стартовий сигнал транскрипції, так як стартовий сигнал трансляції закодовано в самому синтетичному полінуклеотиді.

Першим етапом роботи по одержанню цього гена був хімічний синтез більше 40 олігонуклеотидів — сегментів, із яких складався весь ген. Більшість із них являли собою гексадекануклеотиди. Синтез цих сегментів проводився за допомогою нещодавно розробленого N-метилімідазольного фосфотриефірного методу, що дозволяв значно скоротити час на одержання і очищення кожного олігонуклетиду порівняно з традиційними варіантами триефірного підходу. Основними особливостями цього методу є: використання високоефективних конденсуючих реагентів — арилсульфохлоридів у присутності N-метилімідазолу для створення міжнуклеотндного зв'язку, а також можливість проведення міжнуклеотидних конденсацій не лише в піридині — традиційному розчиннику для олігонуклеотидного синтезу, але і в інших органічних розчинниках, таких, як діоксан, ацетонітрил, хлористий метилен, нітрометан.

Другий етап роботи полягав у ферментативному складанні хімічно синтезованих сегментів за допомогою ДНК-лігази. Складання проводилось у кілька етапів з проміжним клонуванням окремих частин гена. Одержані дволанцюгові полінуклеотиди довжиною 271 і 286 пар основ були вбудовані в плазмідні вектори. Далі після побудови регуляторних ділянок ДНК, що забезпечували експресію генетичного матеріалу, гени було введено в бактеріальні клітини. Одержані штами є продуцентами проінсуліну, який може бути конверсований в активний інсулін.

У 90-их роках на ринок Великобританії надійшли перші партії інсуліну людини. Дозвіл на продаж генно-інженерного інсуліну було одержано компанією «Eli Lilly», яка купила технологію його синтезу із двох бактеріально продукованих А- і В-ланцюгів. Спеціалістам цієї компанії знадобилось чотири роки для покращення процесу хімічного перетворення А- і В-ланцюгів в інсулін і контролю за різними стадіями очистки гормону за допомогою рідинної хроматографії, а також для запровадження розробленої технології в промислову практику. У результаті клінічних випробувань людського інсуліну було виявлено деякі відмінності між його дією і дією препаратів із свинячих та телячих підшлункових залоз. Для одержання відповідного ефекту (за зниженням рівня цукру в крові) нового препарату треба трохи менше, можливо, внаслідок його більш швидкого розсмоктування від місця ін'єкції. У той же час, новий інсулін швидше видаляє із кровотоку кетони. Тож інсулін був першим продуктом бактерій, перетворених генно-інженерними методами, що потрапив у продаж для використання у лікувальній практиці.