3. Вектори.
Після одержання рекомбінантної ДНК, її вводять у живі клітини. Для введення кДНК (генів) у клітини бактерії використовують два методи. Перший заснований на застосуванні плазміди в якості вектора. Це кільцева молекула ДНК (1 — 10 % геному бактерії), кодує важливі генетичні ознаки і має здатність включати в себе нові гени.
При кон'югації бактеріальних клітин відбувається обмін плазмідами бактерій різних видів і родів, але вони не здатні обмінюватись генами що знаходяться в хромосомах. Так клітини пристосовуються і виживають.
Другий метод введення гена в бактеріальні клітини заснований на використанні бактеріофагу в якості вектора. Ген вбудовують в геном вірусу (він містить 10 — 15 генів), і при розмноженні в клітині вірусів необхідний ген проходить процес реплікації.
Під дією рестриктаз (тих же що і для необхідного гена) кільцева структура плазмід (фагів) розщеплюється з утворенням на кінцях „липких” комплементарних участків ДНК. З участю полінуклеотидлігази плазмідна (фагова) ДНК з’єднується з фрагментом ДНК, що переноситься і набуває кільцеву форму. У багатьох випадках лігаза просто замикає плазміду в кільце.
При використанні фага в якості вектора лімітуючим фактором є ємність білкової оболонки (капсида), тому використовуються мутанти з делеціями (втратою частини хромосоми), або штучно (рестриктазами) визивають делецію, завдяки чому в капсид можна помістити необхідні для трансформації гени.
Тож, вектор – це молекула, здатна приєднувати чужорідну ДНК, проникати у клітину, де потім відбуваються процеси її реплікації та експресії. Вектори також повинні володіти такими властивостями як: мати субстратні участки для певних ендонуклеаз рестрикції, містити один або декілька маркерних генів, які після проникнення у клітину надають їй певний фенотип, що свідчить про присутність вектора і полегшує розпізнавання рекомбінованих клітин.
До числа векторів відносяться також віруси рослин і тварин. Одержані також гібридні вектори, наприклад комбінацією плазміди і фага, або з генетичними маркерами, які дозволяють вести відбір рекомбінантних клонів.
У наш час розроблені системи клонування таких векторів у бактеріях, дріжджах, грибах, рослинних і тваринних клітинах. З економічної точки зору великий інтерес становлять системи клонування генів у грампозитивних бактеріях, багато з яких є продуцентами важливих хімічних сполук. Значних успіхів у біоіндустрії досягнуто з клітинами сінної палички, стрептоміцетами та сахароміцетами. Ці організми легко синтезують у культуральну рідину багато білків і мають плазміди, фаги, добре вивчену генетичну систему.
Векторами для таких систем є двойні реплікони (човникові вектори), здатні існувати як у клітині донора, так і в клітині реципієнта. Тобто, створюються гібридні вектори, які містять реплікон пламіди E. coli і необхідний реплікон з бактерій чи дріжджів. Їх одержали комбінацією in vitro фрагментів плазмід цих організмів і хромосомних фрагментів. Їх клонують з відбором у добре вивченій системі (вони містять ген, який надає клітинам добре тестовану ознаку, наприклад стійкість до антибіотиків), потім рекомбінантну плазміду вводять у новий організм.