4. Основні етапи методу генетичної рекомбінації. Способи одержання донорської днк

Основними етапами генетичної рекомбінації є:

1. Одержання донорської ДНК для рекомбінації.

2. Підготовка векторної молекули і одержання рекомбінантної ДНК.

3. Введення рекомбінантної ДНК у клітину.

4. Виділення рекомбінантних клітин.

У генетичній інженерії застосовують 3 основних методи одержання донорської ДНК: 1) „вирізання генів” з допомогою рестриктаз, що можливо лише при обміні генетичною інформацією між прокаріотами; 2) хіміко ферментативний синтез ДНК; 3) синтез ДНК на матриці іРНК.

Перепоною у дослідженні і використанні рекомбінантних ДНК стали відмінності в будові і функціонуванні генів прокаріот і еукаріот. Молекула ДНК еукаріот разом з генетичним кодом білка має ряд регуляторних сигналів (у вигляді спеціальних нуклеотидних послідовностей), розміщені вони часто не поруч з генами. Ці сигнали є відліком початку і закінчення транскрипції (екзони), вони передаються мРНК. Є також інтрони — ділянки, що розділяють сегменти ДНК які кодують один білок, вони не зчитуються мРНК і відповідно не передаються кДНК. ДНК прокаріот не має інтронів, регуляторні ділянки у них розміщені поруч з генами. Тому гени людини вбудовуються у плазміду, клонуються, але не діють, не синтезують білок (мікроорганізми не розуміють „мову” генів людини). Для такої рекомбінації застосовуються два останніх методи одержання генів еукаріот.

У 1970 році американський вчений Г. Тьомін встановив, що синтез ДНК здійснюється на матриці РНК (до цього часу вважали. що лише ДНК на РНК ) з допомогою особливого фермента – ревертази (зворотної транскриптази), який присутній у вірусах. Це відкриття дозволило вирішити дуже складне завдання – синтезувати на іРНК молекули ДНК, які вже не містять нітронів, тому що при утворенні іРНК з неї видаляються з допомогою рестриктаз участки, які відповідають інтронам, тому зони кодування зливаються (сплайсинг). Бактерії змогли розуміти „мову” рослинних і тваринних генів.

Виділення генів (які являють собою сегмент ДНК) біохімічними методами складний процес і залежить від розміру геному (у вірусів — просто, в людини складніше). Тому дослідники частіше виділяють іРНК (мРНК), а потім уже на цій основі синтезують кДНК.

Отже, із специфічних клітин тварин (людини) виділяють мРНК, потім за допомогою зворотної транскриптази синтезують один комплементарний ланцюг ДНК. другий комплементарний ланцюг кДНК одержують з використанням ферменту ДНК - полімерази. Дволанцюгову ДНК вбудовують в плазміду з використанням ферменту — кінцевої трансферази, яка нарощує на кінцях ДНК липкі кінці (лінкери).

Найскладніша операція — виділення з клітин вищих організмів гена, необхідної послідовності ДНК (мРНК). Тому вчені також часто вдаються до хіміко-ферментативного синтезу генів, знаючи амінокислотну послідовність білка, за який відповідає бажана ДНК. Цей метод ефективніший при невеликій довжині поліпептидного ланцюга білкової молекули, як у випадку інсуліну.

2етап. Після розщеплення плазміди на її кінцях за необхідності теж надбудовують послідовність нуклетидів, комплементарних «липким» кінцям ДНК еукаріот. За допомогою ферменту — ДНК-лігази здійснюють зшивання двох нуклеотидних ланцюгів. Одержана кільцева плазміда — рекомбінантна ДНК. Звичайно такі ДНК не проникають через клітинну стінку, але розбавлений розчин СаСl₂ робить клітини більш проникними. Ефективність проникнення екзогенної ДНК невелика, тому серед клітин, які трансформуються лише деяка кількість виявляється трансформованою. Наприклад, процедура введення ДНК у клітини дріжджів проста. Целюлозну клітинну стінку обробляють ферментами, одержують сферопласти. Їх інкубують з донорною ДНК (рекомбінованою плазмідою S.cp.1) додаючи і поліетиленгліколь. Мембрана стає напівпроникною для ДНК. Подальше перенесення клітин на середовище з агаром відновлює клітинну стінку

Виділення таких клітин із загальної маси здійснюється у процесі клонування на середовищі, де виживають лише трансформовані клітини, тому що, завдяки векторній плазміді, містять певний маркер (стійкість до антибіотиків, хімічних речовин та ін.). Рекомбінантні клони можуть бути ідентифіковані за синтезованим ними продуктом, за фенотипом, використовують також метод авторадіографії. Найчастіше ідентифікують безпосередньо нуклеотидну вставку, для чого бактеріальні колонії вирощують на нітроцелюлозних фільтрах, розмішених на чашці Петрі з поживним середовищем. Потім готують репліки: до колоній прижимають свіжий нітроцелюлозний фільтр, який переносять на свіже поживне середовище, де утворюються аналогічні колонії. Фільтр-репліку обробляють лугом, клітини піддаються лізису і денатурована ДНК зв’язується з нітроцелюлозою. Після цього її досліджують. При радіоактивній ДНК (міченій Р³² ) вона ідентифікується радіоавтографічно, або ж витримують фільтри-репліки у розчині з комплементарними клонованій ДНК радіоактивними послідовностями.

Складнощі виникають також із введенням бактеріальної плазміди в рослинні клітини, багато з них нездатні там функціонувати. Але увагу вчених привернула бактерія Agrobacterium tumefaciens, яка визиває спадкові зміни (корончаті галли – пухлини, здатні до безмежного росту). У 1976 р. встановлено, що ця здатність зумовлена наявністю особливої Ті-плазміди, яка функціонує у рослинній клітині. Ведуться наукові пошуки, зокрема по перенесенню гена азотфіксації у рослини.

Експресія чужорідних генів.