2. Попередні відкриття молекулярної біології

Метод рекомбінації полягає у виділенні ДНК різних видів живих організмів, одержанні гібридних молекул ДНК і введенні рекомбінованих молекул у живі клітини щоб домогтися появи нової ознаки, найчастіше, на сучасному етапі — синтезу специфічного білка. Молекула рекомбінантної ДНК є з’єднанням (in vitro) двох компонентів – вектора, що забезпечує механізм реплікації та експресії і фрагмента клонованої ДНК з необхідними генетичними елементами.

Метод рекомбінації не був би можливий без попередніх досягнень молекулярної біології. Бактеріальна клітина складається із клітинної оболонки (20% маси), цитоплазматичної мембрани, в цитоплазмі містяться рибосоми, бактеріальна хромосома у вигляді замкнутої в кільце дволанцюгової молекули ДНК, не оточена оболонкою. У бактеріальній клітині містяться також невеликі кільцеві ДНК – плазміди (1 – 100 штук), які існують відокремлено від хромосоми, містять у 20-1000 разів менше ДНК, але визначають важливі ознаки клітин, мають здатність до реплікації і можуть переноситись із однієї клітини в іншу (відкриті у 1952р. Ледербергом). Якщо в плазміду ввести фрагмент ДНК, то він буде реплікуватись разом із плазмідою. Завдяки цій їх властивості можна розмножати (клонувати) необхідні гени людини.

Важливу роль у розробці методів генетичної інженерії мало відкриття і вивчення специфічних ферментів – рестрикційних ендонуклеаз. Їх відкрили у 50-х роках, коли було виявлене обмежене продукування бактеріофагів в бактеріальній клітині і встановлено, що це дія ферментів, які назвали рестриктазами (від лат. „обмеження”). Вони синтезуються бактеріями і мають здатність розрізати ДНК на лінійні фрагменти у визначеному, специфічному місці, часто з утворенням так званих „липких кінців”. Це „залишки” на кінцях виділеного гена (плазміди) одного ланцюга ДНК, довжиною 1-7 нуклеотидів, з допомогою яких молекули з’єднуються з комплементарними такими ж кінцями плазміди (гена).

Згідно номенклатури, запропонованої Х.Смітом і Д.Натансоном, назва рестриктаз складається з 3 букв: перша означає родову назву, дві наступні – перші букви виду продуцента ферменту, далі слідує штамова (типова) ідентифікація. Наприклад, Есо RI (E. coli  - G – A – A –T –T – C - ) ; Hind II (Haemophilus influenzae  A – A – G –C –T)

- C – T – T – A – A – G - T – T – C – G – А

Порівняння розмірів фрагментів ДНК після обробки участка геному набором рестриктаз дозволяє побудувати рестрикційну карту, яка висвітлює розташування певної послідовності нуклеотидів на цьому участку.

У бактеріальній клітині також синтезуються ферменти здатні зшивати (лігірувати) в єдине ціле фрагменти ДНК. Їх назвали – лігази. Зшивання фрагментів ДНК здійснюють двома основними методами: а) з „липкими кінцями”, утвореними рестриктазами, б) з допомогою штучно добудованих „липких кінців” ” – лінкерів. Часто до лінкера добудовують якийсь регуляторний елемент, наприклад промотор, або участок зв’язування з рибосомою.

Для цього застосовуються кінцеві трансферази, змінюючі структуру кінців молекул (фрагментів) ДНК, ДНК-полімерази та ін. Лише відкриття таких ферментів стало вирішальним у становленні генетичної інженерії. Одержують лігази і рестриктази із бактеріальних клітин як і інші ферменти. Відомо » 500 рестриктаз і кожен фермент розщеплює ДНК специфічно. Їх мікробіологічне промислове виробництво – невіддільна частина сучасної біотехнології і генетично-інженерних досліджень.