Журнал неврологии и психиатрии / 2009 / NEV_2009_08_10

Экспериментально доказано, что кратковременная ишемия мозга вызывает активацию внутриклеточных ферментных процессов, которые в свою очередь способствуют уменьшению очагов деструкции при последующих ишемических эпизодах. Этот феномен был назван ишемической толерантностью.

В зависимости от возможностей генетически детерминированных адаптационных механизмов, организм вырабатывает интегральный тканевой ответ на клеточном уровне, который выражается двумя фазами ишемического прекондиционирования — острой и отдаленной. Острое прекондиционирование возникает в связи с посттрансляционной модификацией белков и продолжается короткий промежуток времени. Развитие отдаленного

прекондиционирования требует синтеза новых белков и продолжается неделями [5, 12, 13]. Последнее может проявиться и в клинических условиях, если предположить, что повторяющиеся транзиторные ишемические атаки являются не только факторами риска развития ишемического инсульта, но и выражением ишемического прекондиционирования.

В литературе обсуждаются различные механизмы, которые могут участвовать в развитии указанного феномена. Один из них подразумевает участие мембранного белка p-21Ras в стимуляции клеточных сигналов, ведущих к синтезу новых белков-протек- торов. Известно, что при ишемии возбужденные нейроны выделяют нейромедиатор глютамат, который, действуя на N-метил-

D-аспартат (NMDA) рецепторы, открывает потенциалзависимые кальциевые каналы и активирует нейрональную NO-синтазу в постсинаптических мембранах с помощью известного белка PSD-95, который способствует переходу p-21Ras с ГДФсвязанной формы в ГТФ-связанную форму. Критическим сайтом для редоксрегуляции p-21Ras является цистеин-118. Нитрозилирование данного сайта способствует прикреплению ГТФсвязанного белка Ras к внутренней поверхности клеточной мембраны. В результате инициированный ферментный каскад передает сигнал пролиферации в ядро клетки и стимулирует синтез новых белков [7, 19]. В экспериментальных моделях мозговой ишемии блокирование сигнальных путей RAS/RAF/MEK/ERK нивелирует развитие толерантности к повторной ишемии. Фосфорилирование названных сигнальных медиаторов стимулирует нуклеарные транскрипционные факторы, индуцирующие гены раннего ответа, которые в свою очередь индуцируют гены отдаленного ответа, в состав которых входят факторы роста, антиоксидантные ферменты, белки ионных каналов, синаптические везикулярные и структурные белки и др. [10].

Если в клинических условиях выявление ишемической толерантности реально, то как долго может продлиться толерантность, вызванная транзиторными ишемическими атаками, и какие молекулярные изменения в острой фазе могут отражать рассматриваемый феномен?

Целью данного исследования являлось изучение связи некоторых участвующих в оксидантных и антиоксидантных процессах белков острой фазы с клиническим течением и функциональным исходом заболевания у пациентов с предшествующими транзиторными ишемическими атаками (ТИА) до развития инсульта и с первичным ишемическим инсультом.

Материал и методы

Обследовали 85 больных с ишемическим инсультом, 38 мужчин и 47 женщин в возрасте от 50 до 70 лет. Критериями исключения были острые воспалительные и аутоиммунные заболевания, тяжелая соматическая патология и кома.

Контрольную группу составили 22 здоровых добровольца соответствующего возраста.

Классификацию TOAST [1] использовали для уточнения патогенетического подтипа инсульта. Из основных факторов риска учитывали наследственность, перенесенную транзиторную ишемию, наличие гиперхолестеринемии, артериальной гипертонии, мерцательной аритмии, сахарного диабета, курение, употребление алкоголя, инфекционные заболевания в течение 2 мес до развития инсульта, психологический и социальный стресс.

Пациенты были разделены на 3 группы: 1-я — 32 пациента с впервые развившимся инсультом, 2-я — 28 пациентов с продромальными ТИА от 1 до 3 мес до развития инсульта и 3-я — 25 пациентов с продромальными ТИА в течение 4 нед до развития инсульта. Неврологический статус оценивали сразу при поступлении больного в клинику по шкале NIHSS. Во всех трех группах изначальная тяжесть инсульта была сопоставима (NIHSS= 12±3,5). На 7-й день от развития заболевания состояние больных снова оценивали по шкале NIHSS с целью изучения клинического течения заболевания. Функциональный исход инсульта определяли по индексу Бартель по истечении 1-го месяца.

Ишемический очаг определяли по истечении 24 ч от развития инсульта с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ, оперативный магнит 0,2 Tл, томограф Vision, «Siemens») по аксиальным срезам толщиной 5 мм в T2-взвешенном режиме. Размер ишемического очага вычислял независимый нейрорадиолог. Лечение больных проводилось общепринятыми при ишемическом инсульте методами.

Для специальных исследований брали пробы венозной крови (10 мл) в течение 24 ч от выявления первых симптомов заболевания. 2 мл крови замораживали в жидком азоте до лабораторного исследования. Свободные радикалы: оксид азота (NO), липо-

пероксид радикал (LOO–), железотранспортные белки крови (окисленный церулоплазмин, Fe3+-трансферрин) определяли по методу электронно-парамагнитного резонанса (ЭПР, спектрофотометр RA-1307). В качестве NO-ловушки использовали диэтилдитиокарбамат. Ловушкой для LOO– служил α-фенил-тетр- бутилнитрон. Интенсивность ЭПР-сигнала измеряли в миллиметрах и рассчитывали на 1 мг вещества крови. 3 мл крови центрифугировали (3000 g/5 мин) и немедленно обрабатывали 20% реагентом (Griess-1879). Нитраты (NO2) определяли спектрофотометрическим методом (спектрофотометр CF-46 LOMO). Калибровочную линию составляли с использованием 50 мкл раствора NaNO2. Оптическую плотность устанавливали на 540 нм. Остальные 5 мл крови использовали для определения эритроцитарной активности глутатион пероксидазы (ГПО) и супероксиддисмутазы (СОД) ранее описанными методами [16, 20].

Для статистической обработки данных применяли компьютерную программу SPSS-11.0. Достоверность вычисляли с помощью t-теста Стьюдента, для вариационного анализа применяли однофазный метод ANOVA. Коэффициент корреляции определяли по Пирсону. Множественную логистическую регрессию применяли для определения средней ожидаемой вероятности.

Результаты и обсуждение

В течение 48 ч от начала инсульта ЭПР-сигналы свободного спин-меченого NO крови были повышены во всех трех группах по сравнению с контрольной (p<0,05), но достоверные различия между клиническими группами обнаружены не были. Высокие ЭПР-сигналы HbNO и FeSNO комплексов были установлены в 1-й и 2-й группах, в то время как такие сигналы не были выявлены в 3-й и контрольной группах. Высокие ЭПР-сигналы крови LOO– обнаруживались во всех клинических группах в отличие от контрольной (p<0,05), но достоверных различий между группами не отмечалось. Сравнительно низкая активность ЭПР-сигналов железотранспортных белков (Fe3+-трансферрин и окисленный церулоплазмин) регистрировалась в 1-й и 2-й группах по сравнению с 3-й группой (p<0,01), но было выявлено достоверное повышение по сравнению с контрольной группой (табл. 1). Показатели NO2 крови были повышены в первых 2 группах по сравнению с контрольной (рис. 1), но существенно понижены по сравнению с 3-й группой (p<0,05). Высокие показатели

Рис. 1. Сравнение содержания NO2 в крови у пациентов различных клинических групп и контролем при остром ишемическом инсульте.

Представлены средние величины и стандартные отклонения. Различие между контрольной и клиническими группами на уровне р<0,05. Различия между 1-й и 2-й клиническими группами не обнаруживались. По оси абсцисс — группы, по оси ординат — NO2, мкмоль/л.

Рис. 2. Сопряженность показателей содержания железотранспортных белков крови с клиническим течением инсульта по шкале NIHSS (ось ординат) на первой неделе заболевания.

Коэффициент корреляции определяли по Пирсону (r=0,37; p<0,05 для окисленного церулоплазмина) и (r=0,31; p<0,05 для Fe3+-трансферрина).

1 — окисленный церулоплазмин, 2 — Fe3+-трансферрин, мкмоль/л.

происходящих в зоне пенумбры, и непрерывно атакуют нервные клетки, вызывая деградацию клеточных мембран и повреждение ДНК [4, 15]. В физиологических условиях эндогенные антиоксидантные механизмы контролируют экспрессию свободных радикалов и защищают клетки от их повреждающего влияния. Можно предположить, что при ТИА организм может адаптироваться к новым условиям, мобилизуя защитные системы против окислительного стресса, а также против других эффектов мозговой ишемии, что подтверждается в различных экспериментальных моделях ишемического прекондиционирования [3, 17, 22]. В данном исследовании активность перекисного окисления липидов проявлялась ЭПР-сигналами LOO– крови, высокая интенсивность которого отмечалась во всех трех клинических группах в отличие от контрольной. Отсутствие существенных различий между группами в отношении вышеназванных сигналов свидетельствовало о схожей интенсивности окислительных процессов в пенумбре, что проявлялось в одинаковых изменениях парамагнитных центров крови [15]. Известно, что NO обладает сильной афинностью к деокси-формам гемоглобина. Формирование стабильных комплексов HbNO крови ингибирует изначальные сосудорасширяющие и антиагрегантные эффекты NO. Ухудшается также транспортная функция гемоглобина и усиливается гипоксия. Появле-

ние в крови высоких ЭПР-сигналов FeSNO указывало на связывание NO с FeS центрами митохондриальных дыхательных белков [8, 9]. Если предположить, что процессы в крови отражают патологические клеточные изменения в регионе пенумбры, становится ясным, что подавление транспорта электронов в ишемизированных нейронах вызывает некроз нервной ткани и, соответственно, проявляется тяжелым течением заболевания [6]. Обычно высвобождение NO из деоксигемоглобина реализуется антиоксидантной системой эритроцитов (глутатионом), который дезинтегрирует комплексы HbNO на NO2. Можно предположить, что высокое содержание NO2 в крови пациентов 3-й группы и отсутствие комплексов HbNO является следствием активности эритроцитарного глутатиона, абсолютное значение которого было повышено в крови указанных пациентов [21]. Существенно повышенные ЭПРсигналы железотранспортных белков (Fe3+-трансферрина и окисленного церулоплазмина) в данной группе больных указывали на подавление связывания NO с FeS центрами дыхательных белков и, как следствие, на увеличение произведения макроэргических энергетических субстратов и улучшение тканевого дыхания. Действие NO в клетках во многом зависит от редокс-потенциала окружающей среды. В присутствии высоких концентраций факторов роста, глюкозы, антиоксидантных белков и др. пероксинитрит (ONOO–), образующийся при взаимодействии NO с О2–, восстанавливается до NO2 [2, 11, 14, 18]. Учитывая, что изначальные размеры ишемического очага не различались в группах, сравнительно более благоприятное течение заболевания и лучший функциональный исход у больных 3-й группы можно объяснить более сильной антиоксидантной эндогенной защитной системой [18].

По-видимому, мобилизация адаптационных механизмов происходит быстрее и полнее у больных с недавно перенесенной транзиторной ишемией. Следовательно, ишемическое прекондиционирование возбуждает серии ферментных сигнальных процессов, которые в итоге вызывают новую форму пластичности нейронов.

Учитывая небольшое количество обследованных нами больных в отдельных группах и сложность рассматриваемой проблемы, по результатам проведенного исследования, можно лишь предположить, что одним из актуальных механизмов ишемического прекондиционирования является увеличение резистентности против оксидантного стресса, которое реализуется через транскрипционную активацию нейропротекторных белков. Дальнейшее исследование мозговой ишемической толерантности имеет значение для более глубокого осмысления феномена, что может привести к новым нейропротекторным стратегиям лечения ишемических инсультов.

ЛИТЕРАТУРА

1.Adams H.P., Bendixen B.H., Kapelle L.J. and the TOAST investigators. Classification of subtypes of acute ischemic stroke. Definitions for use of multicenter clinical trial TOAST. Stroke 1993; 24: 35—41.

2.Beckman J.S., Beckman T.W., Chen J. et al. Apparent hydroxyl radical production by peroxinitrite: implications for endothelial injury from nitric oxide and superoxide. Proc Natl Acad Sci USA 1990: 87: 1620—1624.

3.Buttke T.M., Samdstrom P.A. Oxidative stress as a mediator of apoptosis. Immunol Today 1994; 15: 7—10.

4.Chan P.H. Reactive oxygen radicals in signaling and damage in the ischemic brain. J Cerebr Blood Flow Metab 2001; 21: 2—14.

5.Dirnagle U., Simon R.P., Hallenbeck J.M. Ischemic tolerance and endogeneous neuroprotection. Trends Neurosci 2003; 26: 248—54.

6.Giolivi C. Functional implications of nitric oxide produced by mitochondrial metabolism. Biochem 1998; 332: 637—679.

7.Gonzales-Zalueta M. et al. Requirements for nitric oxide activation of p21 (ras) extracellular regulated kinase in neuronal ischemic preconditioning. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 436—441.

der physiological conditions. Nature 1996; 380: 221—226.

9.Jia L., Bonaventura C., Bonaventura J., Stamler J.S. S-nitrosohemoglobin: a dynamic activity of blood involved in vascular control. Nature 1996; 380: 221—226.

10.Impey S., Obrietan K., Storm D.R. Maiking new connections L role of ERK/ MAPK kinase signalling in neuronal plasticity. Neuron 1999; 23: 11—14.

11.Kim Y.M., Talanian R.V., Billiar T.R. Nitric oxide inhibits apoptosis by preventing increases in caspase-3-like activity via two distinct mechanisms. J Biol Chem 1997; 272: 31138—31148.

12.Kirino T. Ischemic tolerance. J Cereb Blood Flow Metab 2002; 22: 1283— 1296.

13.Kloner R., Jennings R.B. Consequences of brief ischemia: stunning preconditioning and their clinical implications. Circulation 2001; 104: 2981— 2989.

14.Lipton S.A. A redox based mechanism for the neuroprotective and neurodistractive effects of nitric oxide and related nitroso-compounds. Nature 1993; 364: 626—632.

15.Nishio S., Yunok M., Chen Z.F. et al. Ischemic tolerance in the rat neocortex following hypothermic preconditioning. J Neurosurg 2000; 93: 845—851.

erythrocyte glutathione peroxidase. J Lab Clin Med 1967; 70: 58—169.

17.Ravati A., Ahlemeyer B., Becker A. et al. Preconditioning induced neuroprotection is mediated by reactive oxygen species and activation of the transcription factor nuclear factor-κB. Neurochem 2001; 78: 909—919.

18.Sheng H. et al. Mice overexpressing extracellular superoxide dismutase have increased resistance to focal cerebral ischemia. J Neurosci 1999; 88: 185— 191.

19.Siesjo B.K., Zhao Q., Pohlmark K. et al. Glutamate, Calcium and free radicals as mediators of ischemic brain damage. Ann Thorac Surg 1995; 59: 1316—1320.

20.Sun Y., Oberley L.W., Li Y. A simple method for clinical assay of superoxide dismutase. Clin Chem 1988; 34: 497—500.

21.Uakar T.K. et al. Vitamin E, ascorbate, glutathione metabolism in cultures of chick astrocytes plays an important role in antioxidative processes in the brain. J Neurochem 1994; 162: 45—53.

22.Wada K., Miyazawa T., Namura N. et al. Preferential conditions for and possible mechanisms of induction of ischemic tolerance by repeated hyperbaric oxygenation in gerbil hippocampus. Neurosurgery 2001; 49: 160—167.