Журнал неврологии и психиатрии / 2008 / NEV_2008_09_05

Глутатион и ферменты его обмена играют важную роль в толерантности головного мозга к ишемии [1, 15]. По данным литературы, предшественники восстановленного глутатиона (GSH) — его моноэтиловый эфир [10] и N-ацетил- цистеин [19] способны увеличивать концентрацию GSH в клетках, уменьшая размер инфаркта [10, 19] и улучшая исходы инсульта [19]. Получены также данные о значении GSH митохондрий для толерантности к ишемии мозга [24]. Одна-

© Коллектив авторов, 2008

Zh Nevrol Psikhiatr Im SS Korsakova 2008;108:9:36—40

ко истощение GSH не снижает, а увеличивает толерантность к глобальной ишемии (есть и другие отрицательные результаты [7]). Предварительная сверхэкспрессия глутатионпероксидазы (ГПО) защищает от инсульта и отека [17, 25] и ослабляет неврологический дефицит [25], а при нокауте ГПО объем инфаркта возрастает [14]. Однако лечение экзогенной ГПО оказалось неэффективным [26], а антиоксидант эбселен, частичный миметик ГПО, не влиял на ее активность и устранял защиту мозга ишемическим прекондиционированием [21]. Согласно клиническим наблюдениям, уже в первые часы после инсульта в крови увеличивается концентрация GSH и через 1 сутки — ГПО, при этом активность последней отрицательно коррелировала с оцен-

кой по шкале инсульта NIHSS [27]. Было также отмечено, что у части детей с семейным инсультом активность ГПО плазмы значительно снижена [18]. В популяционном исследовании риск инфаркта мозга повышался при низкой концентрациии GSH в плазме [23]. Следует заметить, что авторы приведенных работ исследовали 1—2 показателя, что не позволяет оценить состояние системы глутатиона в целом.

Сильным прямым и вторичным антиоксидантом является α-липоевая кислота (α-ЛК), она увеличивает уровень GSH, восстановленных витаминов С и Е [13, 20], и поэтому названа «антиоксидантом антиоксидантов») [13]. α-ЛК защищает мозг грызунов при ишемии [13, 20] и улучшает состояние больных дисциркуляторной энцефалопатией [9] и инсультом [2, 8]. Однако связь этих изменений с системой глутатиона не изучалась.

Целью работы было исследование концентрации GSH и активности основных ферментов его метаболизма в плазме крови и эритроцитах больных с цереброваскулярными заболеваниями и изучение влияния α-ЛК на обмен глутатиона и ее терапевтического действия при этих формах патологии.

Больным проводили стандартную базисную и дифференцированную (вазоактивную, антиагрегантную и ноотропную) терапию. α-ЛК (берлитион фирмы «Бер- лин-Хеми») вводили капельно внутривенно по 600 мг/сут в течение 10 дней, затем еще 10 дней по 600 мг внутрь.

Состояние больных количественно оценивали по шкале инсульта Национального института здоровья США (NIHSS) [12]. GSH и ферменты его метаболизма ГПО, глутатионтрансферазу (ГТ) и глутатионредуктазу (ГР) определяли стандартными спектрофотометрическими методами [5].

Компоненты системы глутатиона сравнивали по дисперсиям (критерий F) и средним (критерий t Стьюдента). Так как данные по шкале NIHSS отлича- лись от нормального распределения (по тесту Шапи- ро—Уилкса р=0,023), статистический анализ проводили по непараметрическим методам: по критерию Уилкоксона для разностей пар и критерию U Ман- на—Уитни [4]. Описаны только значимые сдвиги (p<0,05).

Материал и методы

Проведено пилотное обследование 135 человек, из них 25 с дисциркуляторной энцефалопатией (ДЭ), 12 — с геморрагическим инсультом (ГИ), 75 — с ишемическим инсультом (ИИ). 23 человека без признаков цереброваскулярных заболеваний составили контрольную группу. Средний возраст больных был 64,9 года, в контроле — 53,4 года; женщин было 57%, мужчин — 43%.

Диагностика цереброваскулярных заболеваний основывалась на клинико-лабораторном и функциональном обследовании с использованием ультразвуковой допплерографии, дуплексного сканирования, эхокардиограммы, компьютерной и магниторезонансной томографии.

Результаты и обсуждение

При ДЭ выявлено выраженное увеличение активности ГТ в эритроцитах и плазме без изменения других показателей (табл. 1). В отличие от этого при ИИ в эритроцитах и плазме резко или выраженно возрастала активность ГПО, в эритроцитах — ГТ, в плазме

— активность ГР и концентрация GSH. При ГИ в плазме увеличивалась активность ГР и особенно ГПО (см. рисунок); меньшая частота значимых изменений может быть связана с малым размером группы. Обращает внимание, что качественно идентичные сдвиги наблюдались только при обоих типах инсульта — ГПО и ГР плазмы, при ДЭ и ИИ — ГТ эритроцитов, но совпадений при всех трех формах цереброваскулярных заболеваний не было. Это свидетельствует о свое-

Система глутатиона при цереброваскулярных заболеваниях.

I Общие обозначения: ДЭ — дисциркуляторная энцефалопатия, ИИ

— ишемический инсульт, ГИ — геморрагический инсульт.

На всех фрагментах значения показателей в контроле приняты за 100% и изображены в виде радиуса окружности. Изменения у больных (выражены в процентах к контролю) нарушают симметрич- ность диаграммы: увеличения показателей изображаются в виде «лу- чей», выступающих за пределы окружности, снижение показателей

— в виде впадин. Черные кружки — р<0,05, светлые — р>0,05; цифры по окружности: 1,5 GSH, 2,6 — глутатионпероксидаза (ГПО), 3,7 — глутатионтрансфераза (ГТ), 4,8 — глутатионредуктаза (ГР); 1—4 — в эритроцитах, 5—8 — в плазме крови.

II Сдвиги в системе глутатиона при ИИ разной степени тяжести и их коррекция. Вверху — легкая степень, посередине — средняя степень, внизу — тяжелая степень; 1 — до лечения, 2 — после стандартной терапии, 3 — то же с добавлением α-липоевой кислоты.

III Система глутатиона при ИИ средней степени А — госпитализация и начало лечения в первые 3 сут (n=19), Б — госпитализация и начало лечения после 3 сут (n=13).

IV Система глутатиона при ИИ тяжелой степени (при поступлении в больницу). В — выжившие пациенты (n=24), Г — пациенты (n=10), умершие через 2—25 сут после исследования крови (медиана — 9 сут).

образии реакций системы глутатиона на различные типы цереброваскулярных заболеваний.

Наиболее широко исследовали больных ИИ (см. рисунок, фрагмент II). При легкой степени тяжести

ÈÈнаблюдалось лишь значительное увеличение активности ГПО в плазме. Для средней степени тяжести ИИ было характерно увеличение в плазме и эритроцитах активности ГТ, только в плазме — концентрации GSH и активности ГПО. При тяжелой степени ИИ как в плазме, так и в эритроцитах возрастала активность ГПО, в плазме — активность ГР, в эритроцитах — концентрация GSH. В целом в этих двух группах из исследованных нами восьми биохимиче- ских показателей значимо (в большинстве случаев — в 1,5—2 раза) увеличивалась половина. Следовательно, сдвиги в обмене глутатиона были распространенными и выраженными. У пациентов средней степени

ÈÈпри поступлении в больницу и начале лечения до 3 сут активности ГПО и ГТ в плазме и эритроцитах были закономерно увеличены, а при более поздней госпитализации этого не наблюдалось, и единственным изменением было увеличение GSH в плазме крови (см. рисунок, фрагмен III). При ИИ тяжелой степени у выживших больных в эритроцитах и особенно плазме происходило накопление GSH и резкое увеличение активности ГПО, повышение активности ГР в плазме. У умерших больных ИИ (через 2— 25 сут после исследования крови, медиана — 9 суток) все эти изменения отсутствовали (см. рисунок, фрагмент IV). He исключено, что это различие можно будет использовать как прогностический тест. Наши данные согласуются с сообщением [11], что активация ГР при хорошем прогнозе выражена больше, чем при плохом (другие реакции системы глутатиона авторы не изучали).

Обращает внимание, что независимо от остроты и тяжести цереброваскулярного заболевания сдвиги всегда заключались в возрастании показателей — увеличении активности ферментов и концентрации GSH. Это означает, что система глутатиона закономерно переходила на более высокий уровень функционирования. При инсульте источником глутатиона и ферментов его метаболизма в плазме могут быть поврежденные нейроны и/или глия. Это связано с тем, что инсульт значительно увеличивает проницаемость гемато-энцефалического барьера [3]. Вероятно, это объясняет большую (7 из 11) часть изменений в плазме.

Наиболее часто увеличивались активности ГПО и ГТ. В литературе данных по ГТ при инсульте мы не обнаружили, но она также является важным антиоксидантным ферментом, который обезвреживает многие окисленные метаболиты путем как восстановления, так и конъюгации и, кроме того, восстанавливает окисленные нуклеотиды в ДНК [6, 16] — это четвертая линия защиты от пероксидации [6]. Активация вспомогательного фермента ГР наблюдалась намного реже, чем ГПО и ГТ, так как его активность как в клетках, так и в плазме намного меньше (см. табл. 1). Обращает внимание, что высокая активность в плазме и эритроцитах ферментов метаболизма глутатиона — ГПО и ГТ — не приводит к снижению его концентрации, а иногда GSH даже накапливается, что может быть связано с увеличенным синтезом GSH в клетках, включая эритроциты, а для плазмы — более легким по сравнению с белками выходом в кровоток глутатиона из поврежденных клеток.

С патобиохимических позиций увеличенное функционирование системы глутатиона противостоит оксидативному стрессу, играющему важную роль в развитии инсульта [3]. Наиболее частый биохимический сдвиг — увеличение активности основных антиоксидантных ферментов ГПО и ГТ — защищает от активных форм О2 и продуктов пероксидации, позволяет в определенной степени восстановить равновесие и улучшить редокс-регуляцию. В пользу такой интерпретации свидетельствуют наши данные об активации при ИИ средней степени ГПО и ГТ в эритроцитах и плазме при относительно ранней, но не поздней госпитализации. Хорошо известно, что при первой состояние и прогноз больных намного лучше благодаря более раннему началу лечения. При тяжелой степени ИИ также можно интерпретировать зна- чительную активацию ряда показателей у выживших и полную ареактивность у умерших пациентов. Вероятно, без защитных реакций системы глутатиона выживание при тяжелом инсульте невозможно. В этом плане самый резкий сдвиг в обмене глутатиона при ИИ — увеличение в плазме в 4,2 раза активности ГПО у тяжелых, но выживших больных может рассматриваться как максимальная защитная реакция. При ИИ средней степени этот показатель увеличивался только в 1,6 раза.

Стандартная терапия ИИ средней степени вернула к уровню контроля два из четырех измененных показателей — активность ГПО и ГТ плазмы (см. рисунок). Добавление к лечению курсового введения α-ЛК нормализовало все показатели. При тяжелой степени ИИ стандартное лечение также повлияло на концентрацию GSH и активность ГПО в эритроцитах и снизило активность ГПО в плазме, увеличило GSH в плазме. Добавление к лечению α-ЛК дополнительно нормализовало еще GSH и ГПО плазмы и снизило активность ГР в эритроцитах. Следователь-

но, и при тяжелом течении заболевания произошли положительные сдвиги, особенно при добавлении α-ЛК, при котором нормализовалось четыре увели- ченных показателей из пяти. Этому мог способствовать новый эффект α-ЛК — стабилизация гематоэнцефалического барьера [22]. Обнаружение при инсульте влияния α-ЛК на активность ферментов метаболизма глутатиона представляет большой интерес. Под- черкнем принципиальное различие значения активности антиоксидантных ферментов в остром периоде и при улучшении состояния: 1) защита от опасного оксидативного стресса (полезная реакция — активация ферментов), 2) результат восстановления баланса оксидантов и антиоксидантов (полезная реакция

— нормализация). Если α-ЛК прямо ингибирует оксидативный стресс, то дальнейшая активация системы глутатиона становится нецелесообразной.

Состояние больных и клиническая эффективность проведенного лечения оценивали по шкале NIHSS, по которой чем выше балл, тем больше степень тяжести состояния больного [12]. При более раннем (до 3 сут) начале лечения средней степени тяжести ИИ медиана баллов NIHSS уменьшилась на 67% (р=0,032), при позднем — изменения отсутствовали (табл. 2). При ИИ средней степени курс стандартной терапии снижал медиану баллов на 38%, такое же лечение с добавлением α-ЛК — на 67%; при тяжелой степени — соответственно на 24 и 48%. Следовательно, все четыре варианта лечения влияли положительно и высокозначимо. Так как тяжесть ИИ значимо не влияла на соотношение лечебных эффектов (р>0,22—0,36), для каждого из двух вариантов терапии мы объединили группы со средней и тяжелой степенью. Это привело к увеличению коли- чества пациентов в группах и в результате к статистической значимости различий между двумя видами терапии: при использовании одностороннего кри-

21—28.

2.Гехт А.Б., Белоусов Ю.Б., Павлов Н.А. и др. Фармакоэкономиче- ское исследование применения метаболически активных препаратов в восстановительном лечении ишемического инсульта. Труды конгресса «Человек и лекарство». М 2005; 347.

3.Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. М 2001; 328.

4.Закс Л. Статистическое оценивание. М 1976; 598.

5.Колесниченко Л.С., Кулинский В.И., Сотникова Г.В., Ковтун В.Ю.

Влияние направленного изменения концентрации глутатиона на температуру тела и толерантность к ишемии головного мозга. Биохимия 2003; 68: 5: 656—663.

6.Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Структура, свойства, биологическая роль и регуляция глутатионпероксидазы. Успехи соврем биол 1993; 113: 1: 107—123.

7.Кулинский В.И., Колесниченко Л.С., Ковтун В.Ю., Сотникова Г.В.

Взаимосвязь толерантности к ишемии головного мозга и температуры тела с концентрацией глутатиона. Биомед химия 2003;

49:5: 424—433.

8.Холопова Е.А. Берлитион в коррекции оксидантного стресса при неврологических заболеваниях. Атмосфера. Нервные болезни 2003; 3: 1—3.

9.Чуканова Е.И., Соколова Н.А. Эффективность тиоктацида при лечении больных дисциркуляторной энцефалопатией. Журн неврол и психиат 2001; 101: 11: 31—34.

10.Anderson M.F., Nilsson M., Eriksson P.S., Sims N.R. Glutathione monoethyl ester provides neuroprotection in a rat model of stroke. Neurosci Lett 2004; 354: 2: 163—165.

11.Aydin M., Gencer M., Cetinkaya Y. et al. PON1 55/192 polymorphism, oxidative stress, prognosis and severity of stroke. IUBMB life 2006; 58: 3: 165—172.

12.Biller J., Love B.B., Marsh E.E. et al. Spontaneous improvement after acute ischemic stroke. A pilot study. Stroke 1990; 21: 7: 1008—1012.

13.Bilska A., Wlodek L. Lipoic acid — the drug of future? Pharmacol Repots 2005; 57: 5: 570—577.

Rev Pharmacol Toxicol 2005; 45: 51—88.

17.Hoehn Â., Yenari N.A., Sapolsky R.M., Steinberg G.K. Glutathione peroxidase overexpression inhibits cytochrome Ñ release and proapoptotic mediators to protect neurons from experimental stroke. Stroke 2003; 34: 10: 2489—2494.

18.Kenet G., Freedman J., Shenkman B. et al. Plasma glutathione peroxidase deficiency and platelet insensitivity to nitric oxide in children with familial stroke. Arteroscler Thromb Vasc Biol 1999; 19: 8: 2017— 2023.

19.Khan M., Sekhon Â., Jatana M. et al. Administration of N-acetyl- cystein after focal cerebral ischemia protects brain and reduced inflammation in a rat model of experimental stroke. J Neurosci Res 2004; 76: 4: 519—527.

20.Packer L., Tritschler H.J., Wessel K. Neuroprotection by the metabolic antioxidant alpha-lipoic acid.Free Radic Biol Med 1997; 22: 1—

2:359—378.

21.Puisieux F., Deplanque D., Bulckaen H. et al. Brain ischemic preconditioning is abolished by antioxidant drugs but not upregulate superoxide dismutase and glutathione peroxidase. Brain Res 2004; 1027: 1—2: 30—37.

22.Schreibelt G., Musters R.J., Reijerkerk A. et al. Lipoic acid affects migration into central nervous system and stabilized blood-brain barrier integrity. J Immunol 2006; 177: 4: 2630—2637.

23.Shimizu H.,Kiyohara Y.,Kato I. et al. Relationship between plasma glutathione levels and cardiovascular disease in defined population: the Hisayama study. Stroke 2004; 35: 9: 2072—2077.

24.Sims N.R., Nilsson M., Muyderman H. Mitochondrial glutathione: a modulator of brain cell death. J Bioenerg Biomembr 2004; 36: 4: 329—333.

25.Weisbrot-Lefkowitz M., Reuhl K., Perry B. et al. Overexpression of human glutathione peroxidase protects transgenic mice against focal cerebral ischemia/reperfusion damage. Brain Res Mol Brain Res 1998; 53: 1—2: 333—338.

26.Yano Ò., Ushijima K., Terasaki H. Failure of glutathione peroxidase to reduce transient ischemic injury in the rat hippocampal subfield. Resuscitation 1998; 39: 1—2: 91—98.

kappaB in neuronal cell death in the glutathione peroxidase-1 knockout mouse in response to ischemia-reperfusion injury. Stroke 2006;

37:6: 1533—1538.

15.Dringen R. Metabolism and function of glutathione in brain. Progress in Neurobiol 2000; 62: 649—671.

acute stroke patients and patients at stroke risk. Eur Neurol 2004; 51: 3: 157—161.