Журнал неврологии и психиатрии / 2007 / NEV_2007_11_10

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

промоторной области гена FMR1 [10]. Подавление транскрипции гена происходит путем изменения конформации метилированного промотора в сильно компактизированную, недоступную для транскрипционного комплекса структуру. Репрессия транскрипции и отсутствие белкового продукта FMRP у всех мужчин и у половины гетерозиготных по мутации женщин ассоциирована с развитием УО и других проявлений СЛХ. Мутации никогда не возникают de novo, а происходят из нестабильных премутационных аллелей [8, 10]. Фенотип больных с СЛХ может быть весьма вариабелен и укладываться в общую клиническую картину УО без ка- ких-то четких специфических проявлений, что ставит для врача-клинициста невыполнимую задачу по дифференциации синдрома. Это делает весьма актуальным использование молекулярно-генетических диагностических процедур при подозрении на СЛХ. Трудность постановки клиниче- ского диагноза и отсутствие эффективных средств для лече- ния больных с СЛХ определяет особую значимость выявления больных с данной патологией и медико-генетического консультирования родственников [2].

Второй по частоте Х-сцепленной формой УО после СЛХ является FRAXE-ассоциированная УО (FRAXE — фолат- чувствительный ломкий участок E на Х-хромосоме). Молекулярная основа данного расстройства связана c экспансией CGG-повторов в промоторной области гена FMR2 (Fragile X Mental Retardation-2) [7].

Целью работы явилось клинико-генетическое изу- чение Х-сцепленной умственной отсталости, вклю- чающее поиск мутаций в генах FMR1 и FMR2, характеристику клинических особенностей выявленных больных с СЛХ и оценку вклада данного расстройства в развитие УО в Республике Башкортостан.

Материал и методы

Для исследования была отобрана группа проживающих в Республике Башкортостан неродственных больных мальчиков (n=214) в возрасте от 3 до 17 лет русской, татарской и башкирской этнической принадлежности.

Во всех этих случаях был поставлен диагноз умственной отсталости (по МКБ-10 рубрика F70—F73). Диагноз верифицировался на основании данных кли- нико-анамнестического обследования, катамнеза, результатов инструментального обследования (запись ЭЭГ, РЭГ), заключения клинического психолога, логопеда, невролога и офтальмолога.

Обследуемые находились на стационарном лече- нии или обследовании в детском отделении Республиканской психиатрической больницы Минздрава Республики Башкортостан Уфы и в Серафимовском детском доме.

В контрольную группу вошли интеллектуально сохранные мальчики (n=217) соответствующего возраста, обучающиеся в среднеобразовательной школе.

Исследование проводилось в период с 2003 по 2004 г.

Для проведения молекулярно-генетического анализа были использованы образцы геномной ДНК обследованных. ДНК выделяли из периферической крови методом феноль- но-хлороформной экстракции [11]. Оценку статуса метилирования CpG-островков генов FMR1 и FMR2 проводили с помощью метилчувствительной полимеразной цепной реакции (МЧ-ПЦР) [3]. Амплификация полиморфных CGGповторов в гене FMR1 осуществлялась c использованием 7-deazaGTP. Результаты амплификации оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последую-

щим окрашиванием бромистым этидием или азотнокислым серебром.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета программ Statistica ver. 6.0 (StatSoft, Inc., 2001), программы RxC (Rows x Columns) [12]. При попарном сравнении частот генотипов, аллелей и ка- чественных признаков в группах больных и здоровых лиц использовался критерий χ2 с поправкой Иэйтса на непрерывность. При числе наблюдаемых случаев менее 5 использовался точный двусторонний критерий Фишера.

Результаты и обсуждение

Молекулярно-генетическая диагностика синдрома ломкой хромосомы Х и FRAXE-ассоциированной умственной отсталости

Учитывая то, что СЛХ является одной из самых распространенных причин наследственной УО, а также невозможность постановки диагноза заболевания только на основании клинических данных в связи с вариабельностью и неопределенностью фенотипиче- ских проявлений, актуальным является молекулярная диагностика СЛХ с целью выявления больных с данной патологией в выборке больных с УО. Основными звеньями патологического процесса при СЛХ являются: экспансия тринуклеотидных CGG-повто- ров в первом экзоне гена FMR1, метилирование CpGостровка этого гена и подавление экспрессии белкового продукта гена FMR1 — FMRP [9, 10]. Молекулярная диагностика синдрома может основываться на выявлении любого из них, на основании чего можно выделить три принципиальных подхода к современной диагностике СЛХ — определение длины тринуклеотидного повтора в промоторе гена FMR1, анализ метилирования промотора и иммунохимические методы определения уровня FMRP в тканях [1, 2, 10].

Âнастоящей работе диагностика СЛХ проводилась с помощью молекулярно-генетического анализа метилирования CpG-островка промоторной области

èанализа CGG-повторов гена FMR1. Метод метил- чувствительной ПЦР позволяет оценить статус метилирования CpG-островка промотора гена FMR1 и дифференцировать премутационные аллели от мутаций по функциональному состоянию. Для обнаружения лиц с СЛХ мы провели анализ метилирования CpG-островка промоторной области гена FMR1 методом метилчувствительной ПЦР у 214 лиц мужского пола с УО.

Âрезультате исследования у 9 (4,2%) больных (4 русских, 4 татар и 1 башкир) обнаружено метилирование CpG-островка гена FMR1, что выражалось в появлении продукта амплификации (рис. 1).

Для выявления больных СЛХ в группе индивидов с умственной отсталостью также было проведено прямое определение числа копий CGG-повторов в гене FMR1. Детекция размера CGG-повторов методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК позволяет выявлять нормальные аллели гена FMR1 (содержащие от 5 до 44 CGG-копий повтора), промежуточные аллели (имеющие от 45 до 54 триплетов), не-

большие премутационные аллели (включающие от 55 до 120 CGG-повторов) и косвенно мутационные (более 200 триплетов) — при отсутствии продукта амплификации. При анализе образцов ДНК 214 лиц с

Рис. 1. Электрофоретическое разделение продуктов метил- чувствительной ПЦР промоторной области гена FMR1.

Дорожки 1 — (+) контроль (здоровая женщина); 2 — (—) контроль (здоровый мужчина); 3, 4, 5, 6 — больные СЛХ; 7 — СЛХ исклю- чен; М — маркер молекулярного веса PuC19/MspI.

Рис. 2. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации CGG-повторов гена FMR1.

Дорожки 1, 2, 4 — аллели с нормальным числом CGG-триплетов; 3, 5 — отсутствие продукта амплификации косвенно указывает на наличие мутации; М — маркер молекулярного веса PuC19/MspI.

УО у 9 больных с ранее обнаруженным метилированием CpG-островка не удалось выявить продукта амплификации, что косвенно указывало на наличие мутационного массива неамплифицируемых CGGтриплетов (рис. 2). Таким образом, в результате проведенного анализа метилирования CpG-островка гена FMR1 и исследования CGG-повторов в данном гене у 9 больных с УО был установлен диагноз: синдром ломкой хромосомы Х. У матери одного из пробандов выявлен премутационный аллель с числом CGG-по- второв 70.

У остальных 205 больных с УО количество CGGповторов варьировало в диапазоне от 21 до 38 копий. В обследованной нами группе пациентов с УО не выявлено случаев носительства ни промежуточных аллелей, ни аллелей, соответствующих состоянию премутации. При анализе распределения частот CGGповторов в гене FMR1 в контрольной группе выявлено 18 аллельных вариантов данного локуса, размер CGG-повторов в которых варьировал в диапазоне 20— 45 копий у лиц татарской этнической принадлежности и 20—38 копий у русских (см. рис. 2). У татар выявлен один случай носительства промежуточного аллеля, содержащего 47 CGG-повторов (1:47, или 2128 на 100 000 населения). Аллелей, соответствующих состоянию премутации, идентифицировано не было.

СИНДРОМ ЛОМКОЙ ХРОМОСОМЫ Х

Статистически значимых различий в распределении частот CGG-повторов в гене FMR1 между здоровыми индивидами татарской и русской этнической принадлежности не выявлено (p<0,05). Распределение частот аллелей данного локуса было бимодальным: основной модальный класс аллелей был представлен 29 и 30 копиями CGG-повтора, определенными с частотой 24,5 и 32,7% среди русских, 17,8 и 22,2% среди татар. Второй модальный пик в распределении частот аллелей данного локуса соответствовал 23 копиям CGG-повтора с частотой 8,2% у русских и 8,8% у татар. Распределение частот аллелей CGG-повторов в исследуемых группах обнаруживало сходство с европейскими популяциями [6].

Таким образом, в ходе молекулярно-генетического анализа гена FMR1 у 9 (4,2%) больных с УО было выявлено метилирование CpG-островка гена FMR1, что позволило установить диагноз СЛХ. При амплификации CGG-повторов у них не удалось выявить продукта ПЦР, что подтверждало наличие мутационных неамплифицируемых аллелей гена FMR1. Это указывает на большую чувствительность применяемых методик и взаимоисключение как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов. В последние годы благодаря развитию методов моле- кулярно-генетической диагностики была произведена существенная коррекция частоты СЛХ как в общей популяции, так и в различных группах риска этого заболевания [13]. Процент больных СЛХ среди мужчин с УО в разных исследованиях варьировал от 0,3 до 16, со средним числом 2,3 [14].

С целью идентификации лиц с FRAXE-ассоции- рованной УО был применен протокол метилчувствительной ПЦР, позволяющий определять состояние метилирования CpG-островка промоторной области гена FMR2. Для оценки чувствительности метода была проведена проверка протокола в контрольных группах, состоявших из 20 здоровых женщин и 30 здоровых мужчин. Анализ метилирования в перечисленных контрольных группах показал полное отсутствие метилирования исследуемых фрагментов у всех здоровых мужчин и наличия метилирования у женщин, что подтверждало высокую чувствительность данной методики.

При анализе метилирования CpG-островка промоторной области гена FMR2 у больных с УО не удалось выявить ни одного больного с метилированным промотором этого гена, что косвенно подтверждает данные о низкой распространенности (1 на 50 000— 100 000 мужчин) FRAXE-ассоциированной УО [7].

Молекулярно-генетическая диагностика СЛХ

В настоящей работе молекулярно-генетическая диагностика СЛХ проводилась с помощью двух методов: анализа метилирования CpG-островка промоторной области и анализа CGG-повторов в гене FMR1. Полученные положительные результаты использования данных методов позволяют предложить следующий протокол диагностики СЛХ в Республике Башкортостан по схеме:

1. Исследование кариотипа обследуемого для исключения хромосомной патологии, не имеющей отношения к синдрому ломкой хромосомы Х.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

2.Амплификация области CGG-повторов в гене FMR1. Наличие продукта амплификации, соответствующего нормальному аллелю данного ДНК-ло- куса, рассматривается как достоверный признак отсутствия мутации гена FMR1 с исключением диагноза СЛХ.

3.В случае отсутствия продукта амплификации области CGG-повторов в гене FMR1 проводится анализ статуса метилирования CpG-островка гена FMR1. Диагноз СЛХ подтверждается при выявлении метилирования промоторной области этого гена.

Применение комплексного взаимодополняемого теста с использованием ПЦР-анализа CGG-трипле- тов и метилирования CpG-островка гена FMR1 является надежным диагностическим методом и применение его в диагностике СЛХ у мальчиков не требует привлечения других методов ДНК-диагностики

[4].Однако для гетерозиготных носительниц мутантного гена FMR1 молекулярно-генетическая диагностика с помощью приведенной выше схемы затруднена из-за наличия у них второй нормальной Х-хро- мосомы. Методом прямой диагностики СЛХ для них является метод блот-гибридизации по Саузерну или метилспецифичная ПЦР.

Поскольку в настоящее время известно, что мутации в гене FMR1 никогда не возникают de novo, а происходят из нестабильных премутационных аллелей, очевидно, что программа скрининга новорожденных на носительство премутационных и мутационных аллелей гена FMR1 позволила бы зна- чительно снизить частоту этого расстройства [9]. Сочетание молекулярно-генетической диагностики СЛХ среди пациентов с УО и неонатального скрининга мальчиков с последующим каскадным скринингом в семьях с выявленными больными СЛХ является наиболее подходящей и экономически целесообразной стратегией снижения популяционной частоты СЛХ.

Клиническая характеристика больных СЛХ

Клинический анализ проведен ретроспективно на основании данных историй болезни. У детей с СЛХ статистически значимо чаще, чем в общей выборке больных с УО, встречались речевые нарушения (в 44,4% случаев по сравнению с 7,8%, p=0,005) и гипердинамический синдром (в 66,6% случаев по сравнению с 13,7%, p<0,001). По поводу макроорхизма двое больных СЛХ были проконсультированы урологом, им даны рекомендации: лечение у эндокринолога. Кроме того, у детей с СЛХ выявлялись характерные лицевые аномалии: макро- и долихоцефали- ческая форма черепа, несколько удлиненное лицо, широкий прямой лоб, увеличенные лобные бугры, несколько уплощенная и гипоплазированная средняя часть лица, высокие аркообразные брови, своеобразная форма носа со слегка клювовидно загнутым тупым кончиком, большой выступающий подбородок, толстые губы, увеличенные центральные верхние резцы. Особенно характерными были крупные, оттопыренные, низко расположенные ушные раковины (рис. 3). Наблюдались доброкачественный судорожный синдром, гипердинамический синдром. В личностной структуре больных с СЛХ превалировали черты сенситивности,

Рис. 3. Фенотип больного с синдромом ломкой хромосомы Х.

повышенной чувствительности, смущаемости с быстрым отказом от любого общения, избеганием визуального контакта. Полученные результаты преобладания среди лиц с СЛХ речевых нарушений, гипердинамического синдрома и макроорхизма согласуются с данными литературы [1, 8]. При анализе анамнестических данных было выявлено, что у детей с СЛХ чаще наследственность была отягощена психоневрологическими заболеваниями со стороны матери (в 33,4% случаев по сравнению с 13,9% в общей выборке УО).

Таким образом, выявлены более высокая частота отягощенной наследственности психоневрологическими заболеваниями со стороны матери и характерные клинические признаки СЛХ: речевые нарушения (общее недоразвитие речи, дизартрия, персеверации), лицевые аномалии у лиц с СЛХ.

В ходе проведенного исследования установлено, что синдром ломкой хромосомы Х в Республике Башкортостан составляет около 4,2% случаев УО. Выявлены характерные клинические особенности у больных с синдромом ломкой хромосомы Х: речевые нарушения (общее недоразвитие речи, дизартрия, персеверации), лицевые аномалии. Внедрен в клиниче- скую практику эффективный протокол молекулярногенетической диагностики синдрома ломкой хромосомы Х в Республике Башкортостан, заключающийся в предварительном выявлении индивидов, не имеющих нормального аллеля гена FMR1, с последующей оценкой у них статуса метилирования CpGостровка. Обнаружено 18 вариантов аллелей CGGповторов в гене FMR1 с бимодальным распределением их частот в этнических группах русских и татар, что соответствует таковому в большинстве изученных европейских популяций.

Полученные в работе данные по клинико-гене- тическому исследованию синдрома ломкой хромосо-

мы Х имеют существенное значение для проведения ДНК-диагностики этого синдрома, в том числе пренатальной, для определения риска развития заболевания в отягощенных семьях. Кроме того, проведенное исследование послужило основой для создания

СИНДРОМ ЛОМКОЙ ХРОМОСОМЫ Х

Интернет-ресурса, посвященного синдрому ломкой хромосомы Х, где подробно раскрыты клинико-ге- нетические аспекты и доступные методы диагностики расстройства.

Работа выполнена при поддержке грантов РГНФ и РФФИ.

Клинико-генетические аспекты синдрома ломкой Х-хромосо- мы. Журн неврол и психиат 2005; 8: 69—74.

3.Стрельников В., Немцова М., Блинникова О. и др. Современные методы ДНК-диагностики синдрома Мартина—Белл. Педиатрия 2000; 4; 21—25.

4.Толмачева Е.Н. Диагностика синдрома ломкой Х-хромосомы. Современные медицинские технологии. Новосибирск 1999; 342— 343.

5.Crawford D., Acuna J., Sherman S. FMR1 and the fragile X syndrome: human genome epidemiology review. Med Genet 2001; 3: 359—371.

6.Fu Y., Kuhl D., Pizzuti A. et al. Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox. Cell 1991; 67: 1047—1058.

7.Gecz J., Gedeon K., Sutherland R., Mulley C. Identification of the gene FMR2, associated with FRAXE mental retardation. Nature Genet 1996; 13: 105—108.

syndrome. Hum Mol Genet 2000; 9: 8—901.

10.Mandel J., Biancalana V. Fragile X mental retardation syndrome: from pathogenesis to diagnostic issues. Growth Hormone and IGF Research 2004; 14: 158—165.

11.Mathhew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA. Methods in Molecular Biology. Human Press 1984; 2: 31— 34.

12.Roff A., Bentzen P. The statistical analysis of mitochondrial DNA: χ2 and problem of small samples. Mol Biol Evol 1989; 6: 539—545.

13.Song F., Barton P., Sleightholme V. et al. Screening for fragile X syndrome: a literature review and modelling study. Health Technology Assessment 2003; 7: 16.

14.Turner G., Webb T., Wake S., Robinson H. Prevalence of fragile X syndrome. Am J Med Genet 1996; 64: 7—196.