Pivovarennaya_inzheneria_ / Глава 3

метаболиты, накапливаясь в биореакторе, оказывают неблагоприятное (токсичное) вли яние на культуру, в результате чего с некоторого момента рост популяции замедляется.

Поскольку время генерации g характеризуется удвоением биомассы (см. раздел 3.2.1.1), то при τ = g, → m = 2m0.

Подставим эти условия в выражение 3.8:

Поделив левую и правую части этого уравнения на m0 и прологарифмировав его,

Отсюда можно получить соотношения между удельной скоростью роста µ, време

3.2.2.4. Влияние внешних факторов на развитие микроорганизмов

Условия среды обитания оказывают существенное влияние на рост и развитие мик робной популяции, поэтому очень важно обеспечить в биореакторе такие параметры куль тивирования, которые были бы наиболее благоприятны для выращиваемой культуры, при которых удельная скорость роста имела бы достаточно высокое значение.

Удельная скорость роста µ является комплексным показателем развития микроорга низмов, учитывающим не только физиологические свойства культуры, но и влияние раз нообразных внешних факторов. В реальных условиях культивирования она всегда ниже своего максимально возможного значения, являющегося кинетической константой µmax, определяемой экспериментально. Представив влияние наиболее значимых внешних фак торов как произведение некоторых функций, величина которого лежит в интервале от 0 до 1, можно выразить µ (ч–1) в виде

где t — температура культивирования, °С; pH — водородный показатель среды в биореак торе; C — концентрация растворенного кислорода в культуральной жидкости, г/м3; S — концентрация лимитирующего субстрата в биореакторе, кг/м3; P — концентрация продукта метаболизма в биореакторе, кг/м3.

Многоточие в выражении (3.17) означает, что его можно было бы дополнить други ми функциями, характеризующими влияние менее значащих факторов, например, кон центраций диоксида углерода, биомассы и пр.

Рассмотрим выражение (3.17) исходя из принципа независимости, в соответствии с которым удельная скорость роста независима от не изменяющихся (стабильных) параметров. То есть если группу параметров, кроме одного, поддерживать на постоян ном уровне, то удельная скорость роста будет зависеть только от этого одного перемен ного параметра.

3.2.2.4.1. Влияние температуры

Примем значения рН и концентрации растворенного кислорода, лимитирующего субстрата и ингибирующего метаболита постоянными, при которых обеспечивается удовлетворительное развитие культуры. При этом произведение функций, описывающих влияние этих параметров на удельную скорость роста, также будет постоянным, то есть f2(pH) f3(C) f4(S) f5(P) = const. Тогда, в соответствии с принципом независимости, выражение (3.17) можно представить как функцию только одного переменного параметра

3.2.2.4.2. Влияние рН культуральной среды

При постоянных температурах и концентрациях растворенного кислорода, лими тирующего субстрата и ингибирующего метаболита значение произведения функций, описывающих влияние этих параметров на удельную скорость роста, будет постоянным,

Кислород плохо растворим в жидкости. Например, равновесная концентрация ра створенного кислорода в воде при нормальных условиях и при контакте ее с воздухом, в котором 21% О2 (то есть при парциальном давлении 150 мм рт. ст.), составляет около 7 г/м3. В культуральных жидкостях, представляющих солевые растворы, раствори мость кислорода ниже и обычно лежит в пределах 4–6 г/м3. В то же время скорость потребления кислорода большинством микроорганизмов достаточно велика и состав ляет 0,2–0,3 г/(м3 с). При такой интенсивности дыхания растворенный кислород бу дет потреблен культурой за очень короткий промежуток времени. Поэтому для нор мального роста и развития аэробных микроорганизмов (или дрожжей для накопления биомассы) необходимо обеспечить эффективную аэрацию в биореакторе.

При постоянных температурах, значениях рН, концентрациях лимитирующего суб страта и ингибирующего метаболита значение произведения функций, описывающих влияние этих параметров на удельную скорость роста, будет постоянным, т. е. f1(t) f2(рН) f4(S) f5(P) = const. Тогда, в соответствии с принципом независимости, вы ражение (3.17) можно представить в виде

3.2.2.4.4. Влияние концентрации питательных веществ

Учитывая, что питательная среда для культивирования микроорганизмов представ ляет собой многокомпонентную смесь, то исследование ее влияния на развитие мик роорганизмов осуществляют по лимитирующему субстрату, который представляет собой один из компонентов питательной среды, оказывающий наибольшее влияние на рост и развитие микробной популяции.

3.2.2.5. Основное уравнение микрокинетики роста микроорганизмов

Рассмотрев влияние отдельных параметров на удельную скорость роста, предста вим выражение (3.17), заменив в нем обозначения соответствующих функций их ана литическими выражениями, в виде

Выражение (3.34), называемое уравнением Моно–Иерусалимского, описывает мик рокинетику роста микроорганизмов. Оно, как видно, не учитывает влияния концентра ции растворенного кислорода, температуры и рН, поскольку этими параметрами можно управлять и поддерживать на оптимальных уровнях, вследствие чего каждая из функций f1(t), f2(рН) и f3(С) будет приближаться к единице.

Уравнение (3.34) содержит две неизвестных величины, что затрудняет практичес кие расчеты; к тому же весьма затруднительно определить, какой именно продукт ме таболизма оказывает большее негативное влияние на рост микроорганизмов. Поэтому было предложено исключить из уравнения (3.34) переменную Р исходя из предполо жения (справедливость которого была многократно подтверждена практически) что концентрация образующихся продуктов метаболизма пропорциональна количеству переработанного субстрата:

где А — коэффициент пропорциональности — константа, представляющая экономиче ский показатель продуктообразования относительно потребления субстрата, кг/кг; S0, S — соответственно начальная и текущая концентрации субстрата, кг/м3.

Введем новую константу Kps = Kp /А и с учетом ее и выражения (3.35) преобразуем уравнение (3.34) в виде

где Kps — концентрация субстрата, которая, будучи переработанной микроорганизмами приводит к выделению такого количества продуктов метаболизма, которые понижают удельную скорость роста вдвое, кг/м3.

3.2.2.6. Кинетика развития микроорганизмов в биореакторе периодического действия

На пивоваренных предприятиях значительно чаще используют установки для пе риодического культивирования, которое характеризуется единством места проведе ния всех стадий и их разновременностью при изменяющихся параметрах. Например, в биореакторе периодического действия могут осуществляться последовательно сле дующие стадии: загрузка питательной среды (в качестве которой используют сусло),

ее стерилизация, внесение посевного материала, культивирование популяции микро организмов, выгрузка готовой культуры, мойка и стерилизация биореактора и комму никаций установки.

В реальных условиях периодического культивирования микроорганизмов их рост не может продолжаться бесконечно, поскольку начинают проявляться влияния на культуру неблагоприятных факторов — изменение состава (истощение) питательной среды, воздействие на клетки накапливаемых продуктов метаболизма, ухудшение мас сопереноса и взаимное негативное влияние микроорганизмов из за увеличения их плотности. Все это сказывается на жизнедеятельности микроорганизмов и их рост замедляется, а затем и прекращается. Поэтому уравнения (3.8)–(3.10) справедливы лишь для определенного этапа развития микробной популяции, называемой фазой экспоненциального роста микроорганизмов.

Типичный характер изменения концентрации микроорганизмов в процессе перио дического культивирования показан на рис. 3.9.

Цикл периодического культивирования микроорганизмов в ограниченном простран стве включает пять стадий, характеризующихся различными скоростями роста культуры.

Вначале культивирования (участок АВ) рост биомассы практически не наблюдает ся, то есть скорость роста близка к нулю. Этот этап культивирования называют лагфазой (от англ. lag отставание, задержка), или фазой разбега. В этот период посевная культу ра осваивается в новой среде обитания, размер клеток увеличивается, в них активизи руются биохимические процессы, синтезируются ферменты, возрастает содержание нуклеиновых кислот. В лагфазе происходит подготовка культуры к размножению.

Вфазе экспоненциального или, как ее иногда называют, логарифмического роста — логфазе (участок ВС), описываемой уравнениями (3.8)–(3.10), осуществляется сба

лансированный рост культуры с постоянной и максимальной для конкретных условий удельной скоростью роста, поскольку в этот период (в течение ≈ 15–24 ч) развитие

микроорганизмов не лимитируется недостатком питательных веществ и не тормо зится накоплением токсичных продуктов метаболизма. Общая скорость роста мик роорганизмов в этой фазе постоянно возрастает и достигает максимального значе ния в точке С. Время генерации, за которое число клеток удваивается, достигает своего минимума.

Фаза замедленного роста (участок СD) обусловлена исчерпанием питательных веществ в среде (в частности, свободного аминного азота, ростовых веществ), накоп лением токсичных продуктов метаболизма (при концентрации этанола более 0,7% объемных) и ухудшением массообмена вследствие увеличения плотности биомассы в биореакторе. Общая скорость роста микроорганизмов при этом постепенно снижа ется до нуля.

Встационарной фазе (участок DЕ) прирост клеток равен их естественной убыли, вследствие этого биомасса в биореакторе практически не возрастает. Общая скорость роста в этот период равна нулю.

Вфазе отмирания (участок ЕJ) гибель клеток и автолиз биомассы начинают домини ровать над приростом, в результате чего происходит постепенное снижение числа жиз неспособных клеток. В этом случае общая скорость роста имеет отрицательное значение (поэтому в данном случае правильнее было бы называть ее скоростью отмирания).

На практике культивирование микроорганизмов осуществляют, не доводя культу

ру до фазы отмирания.

Удельная скорость потребления микроорганизмами субстрата (кг/м3 ч) пропорци ональна темпам наращивания биомассы, но противоположна по знаку:

где αS — стехиометрический коэффициент по углеродсодержащему субстрату (удель ный расход углеродсодержащего субстрата, необходимый для образования 1 кг абсо лютно сухого вещества), кг/кг.

где S0, S — соответственно начальная и текущая концентрации субстрата, кг/м3; x — концентрация биомассы в текущий момент времени, кг/м3.

Удельная скорость образования целевого продукта метаболизма описывается урав нением

где αр — стехиометрический коэффициент по целевому продукту метаболизма, соот ветствующий количеству этого продукта, выделяемого в культуральную среду при образовании 1 кг биомассы, кг/кг.

Таким образом, совокупность уравнений (3.9), (3.37) и (3.39) представляет собой простейшую математическую модель развития популяции микроорганизмов в фазе экспоненциального роста в биореакторе периодического действия.

3.3.ИНЖЕНЕРНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ПОЛУЧЕНИЯ

ИХРАНЕНИЯ ПИВНЫХ ДРОЖЖЕЙ

3.3.1.Ретроспективный взгляд на получение чистой культуры дрожжей

До недавнего времени сбраживание сусла осуществляли преимущественно осадочны ми пивными дрожжами, что являлось причиной нестабильности биологического состоя ния применяемых дрожжей, качества пива и колебаний его органолептических свойств. Физиологическое состояние дрожжей изменялось от генерации к генерации и приводило к старению культуры, а следовательно, к замедлению сбраживания сусла, снижению спо собности клеток к размножению, нетипичному их поведению при брожении и мутациям. Особенно это ощущается при использовании ЦКБА, поскольку в них дрожжи подверга ются дополнительному стрессу вследствие повышенного гидростатического давления.

Вконце ХIХ в. Э. Хансен впервые выделил одиночную дрожжевую клетку и обеспе чил ее развитие в искусственной среде. Он же вместе с Кюле в 1890 г. разработал первую дрожжерастильную установку, состоящую из суслоприемника и резервуара для разведе ния дрожжей с подводом стерильного воздуха и перемешивающим устройством. Ос новные принципы этой системы разведения дрожжей до сих пор используются в пиво варении.

ВХХ в. для получения чистой культуры дрожжей достаточно широко использовали установки Грейнера (рис. 3.10). Отличительной особенностью установок этого типа яв ляется то, что культивирование дрожжей в них осуществляют последовательно в биоре акторах с различной вместимостью. Установка включает в себя: стерилизатор сусла 1, бро дильные цилиндры 2, снаружи которых укреплены стеклянные сосуды для маточных дрож жей 3, аппарат предварительного брожения 4. Все сосуды оснащены гидравлическими затворами, через которые удаляется отработанный воздух и образующийся диоксид угле рода. Стерилизатор и аппарат для предварительного брожения оснащены охлаждающи ми и нагревающими змеевиками. Через верхние змеевики прокачивают охлаждающий агент, как правило, холодную воду. В нижние змеевики подают греющий пар. Конденсат из нагревающих змеевиков отводят через конденсатоотводчики. Все воздуховоды, по которым к сосудам подводят сжатый воздух для аэрирования или для передавливания среды, оснащены ватными фильтрами, предварительно простерилизованными в авто клаве при температуре 120 °С в течение 4 ч или при 150 °С в течение 2 ч. Бродильные цилиндры оснащены специальными штуцерами для внесения посевного материала, полученного в лаборатории.

Материал, из которого изготовлены сосуды установки Грейнера, — нержавеющая сталь. Ранее их изготавливали из меди, луженой с внутренней стороны сосуда оловом, поскольку ионы меди вызывают дегенерацию дрожжевых клеток. Однако слой олова быстро разрушался, и его приходилось регулярно обновлять.

Перед началом работы и между циклами культивирования аппараты установки сте рилизуют острым паром при давлении 0,05 МПа в течение получаса. Пар подают через суслопровод и выпускают через все остальные штуцера и краны.

Количество бродильных цилиндров в установке может быть от 1 до 4 штук в зави симости от количества рас дрожжей, культивируемых в установке.