gerasimenko_n_n_zaicev_s_a_tehnologii_izgotovleniya_nanostru

Металлические нанокластеры

Описанные здесь методы синтеза кластеров дают лишь общее представление о способах их получения. Существует множество других способов синтеза кластеров (в том числе и непосредственно в матрицах), однако все эти методы направлены на получение кластеров не в чистом виде, а в оболочке или в матрице, либо кластеры не являются основными продуктами синтеза.

71

Металлические нанокластеры

Контрольные вопросы

1.Назовите основные положения капельной теории зародышеобразования.

2.В каких пределах она применима? Ответ обоснуйте.

3.Опишите метод синтеза кластеров путем конденсации из газовой фазы.

4.В чем суть метода «вмораживания» кластеров в инертную

матрицу

5.Опишите метод получения нанокластеров с использованием нанореакторов.

Литература

1.А.А. Елисеев, А.В. Лукашин. Функциональные наноматериалы/ под ред. Ю.Д. Третьякова. М.: ФИЗМАТЛИТ, 2010.

2.Рыжонков Д.И., В.В. Лёвина, Э.Л. Дзидзигури. Наноматериалы. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2010.

72

6.Биологические сенсоры на основе наноматериалов

6.1.Принципы функционирования биосенсоров

иподбора материала для них

Наноматериалы получили широкое применение в качестве основной составляющей различных химических и биологических сенсоров. Сенсоры на основе наноматериалов позволяют проводить эффективный экспресс-анализ сложных биологических систем, таких как кровь, с высокой чувствительностью, позволяющей обнаруживать до 50 молекул детектируемого вещества.

Спектр наноматериалов, используемых в сенсорах, достаточно широк. Анализ публикаций последних лет позволил выявить различные по структуре наноматериалы, нашедшие применение в химических сенсорах. К ним можно отнести следующие группы наноматериалов:

наночастицы, нанокластеры, нанокристаллы и квантовые точки, используемые в основном в оптических, в том числе и в биохимическихсенсорах, иммуносенсорах, режевэлектрохимическихсенсорах;

нанотрубки, наностержни, наноленты, нанопроволоки, применяемые в первую очередь в электрических (эффект полевого транзистора) и электрохимических сенсорах, реже в оптических (биохимических) и пьезосенсорах;

сенсоры, основанные на использовании наноразмерных организованных пленочных структур (пленки Ленгмюра—Блоджетт и самоорганизованные моно- и полислои), применяемые в основном в оптических, поверхностно-акустических и пьезокварцевых (объемноакустических) сенсорах.

В наносенсорах наиболее часто применяются так называемые нульмерные материалы: наночастицы, нанокристаллы, нанокластеры и квантовые точки. Они представляют собой ансамбли из нескольких сотен или тысяч атомов или молекул размером в несколько нанометров, с дискретными уровнями энергии и единичным электрическим зарядом. Поскольку размер таких наночастиц меньше волны де Бройля электрона, они способны интенсивно поглощать энергию электромагнитного излучения в видимой или ближней УФ-области электромагнитного спектра.

Возникновение цвета у наночастиц благородных металлов (Au, Ag)

ииногда Cu и Al вызвано эффектом локального поверхностного плазмонного резонанса, обусловленного резонансом частоты падающего

73

Биологические сенсоры на основе наноматериалов

света (энергии фотона) с коллективно (как один целый заряд) осциллирующими свободными электронами металла, определяющими его проводимость. Результатом этого эффекта является сильное увеличение поглощения и рассеяния электромагнитной энергии, возникновение яркой окраски и других необычных оптических свойств частиц металлов, на чем основано их применение в оптических сенсорах. Цвет таких частиц зависит от их размера, формы, природы материала

ифактически отсутствует у данного вещества в обычном состоянии. В сравнении с красителями интенсивность поглощения и рассеяния света наночастицами на несколько порядков выше. Например, рассчитан-

ный молярный коэффициент поглощения частиц золота диаметром 40 нм при длине волны света 530 нм равен 7,7·109М–1·см–1, в то время как

для наиболее интенсивно поглощающего свет родамина 6Ж при этой же длине волны только 1,2·105М–1·см–1.

В1996 году появилась первая работа по применению золотых наночастиц для определения олигонуклеотидов. Детектирование основано на зависимости цвета наночастиц золота (или серебра) от локального коэффициента преломления и диэлектрических свойств локального внешнего окружения, определяемых монослоем привитых к наночастице алкантиольных молекул, антител или аптамеров, которые изменяются при взаимодействии с аналитом. Химическая модификация наночастиц монослоями указанных органических или биоорганических соединений обусловливает селективность детектирования. В связи с этим наносенсоры, основанные на эффекте поверхностного плазмонного резонанса, широко используются в качестве биосенсоров

ирассматриваются как многообещающая альтернатива иммуносенсорам. Например, описано количественное детектирование стрептавидина на уровне пикомолей на серебряных трехгранных наночастицах.

Углеродные нанотрубки обладают рядом уникальных свойств, обусловливающих перспективность их использования в химических сенсорах. Они характеризуются очень высокой прочностью, превосходящей прочность стали, и вместе с тем хорошей деформационной упругостью. Отчасти это объясняется геометрией их структуры, которая равномерно распределяет нагрузку, а также прочностью межуглеродных связей.

Углеродные нанотрубки отличаются широким диапазоном электрических свойств. Большинство трубок — полупроводники, но есть и прекрасные проводники (в частности, лучшие, чем серебро) и даже изоляторы. Проводимость нанотрубки зависит от ее геометрического строения, а именно от ориентации графитовой плоскости относительно оси нанотрубки. Высокое соотношение длина—радиус нанотрубки

74

Биологические сенсоры на основе наноматериалов

(порядка 1000:1) позволяет контролировать свойства этих материалов в определенном направлении. Большая площадь поверхности нанотрубок обеспечивает эффективную адсорбцию многих веществ: различных газов, диоксинов, ионов фтора, свинца и т.д.

Поверхность углеродных нанотрубок можно модифицировать функциональными группами (например, карбоксильными) и допировать другими атомами (введением внутрь нанотрубки или в межслоевое пространство).

Широкое применение углеродные нанотрубки нашли в биохимических сенсорах, в основном амперометрического типа. При этом нанотрубки вводят в покрытие из полимера или композиционного материала, нанесенного на поверхность электрода, что позволяет детектировать многие электроактивные вещества при низком перенапряжении, обеспечивающем хорошую селективность определения в сложных матрицах. Достигнуто увеличение сигнала ферментного сенсора на глюкозу более чем на порядок в случае использования углеродных нанотрубок. Предложены также сенсоры такого типа на галактозу, гидразин, аминокислоты и альбумин, рутин.

Часто углеродные нанотрубки применяют в комбинации с другими наноматериалами: наночастицами благородных металлов, самоорганизованными монослоями и пленками Ленгмюра—Блоджетт, что улучшает метрологические характеристики сенсоров. Так, композиционные материалы на основе углеродных нанотрубок и наночастиц золота позволили в два раза снизить предел обнаружения глюкозы и увеличить срок службы сенсора от 1 дня до 3-х месяцев по сравнению

снемодифицированной углеродной нанотрубкой.

Вработе [1] авторы показали возможность детектирования отдельных биологических молекул в среде биологических жидкостей (в клетке). Предложенный метод основан на использовании одностенных нанотрубок, в которых при адсорбции детектируемых молекул меняется электронная структура, что отражается на изменении интенсивности оптического излучения нанотрубки, либо приводит к смещению длины волны излучения. Применяя этот метод, авторы сумели добиться детектирования различных биологических веществ, в частности лекарств, применяемых при химиотерапии и активных кислородсодержащих веществ, а также пероксида водорода.

Ещё один мощный и широко распространенный метод исследования клеточной структуры и организации основан на применении флюоресцентных меток. Для подсвечивания структурных особенностей используют биохимические зонды (зачастую антитела), функционализированные флюоресцентными красителями. Например, акти-

75

Биологические сенсоры на основе наноматериалов

новый цитоскелет клетки зачастую подсвечивают с помощью сопряженного фаллоидина. Несколько другой подход к сверхчувствительному анализу предоставляют наночастицы. Квантовые точки, изготов ленные из материалов с высоким выходом флюоресценции, таких как селенид кадмия, позволяют проводить оптический анализ с большой экспозицией без проблем фотообесцвечивания, обычно сопутствующих флюоресцентным меткам. Однако с квантовыми точками возникает другая проблема: в большинстве случаев они являются цитотоксичными. Поэтому на них приходится адсорбировать инертную в клеточном окружении молекулярную оболочку. В случае CdSe используют алкантиолы, которые довольно сильно взаимодействуют с селенидом кадмия и пассивируют его. Другой подход основан на применении наночастиц золота, которые тоже могут быть пассивированы ал- канти-олами и использованы для зондирования клеточной структуры.

6.2. «Лаборатории на чипе»

Миниатюаризация аналитических систем представляет большую пользу для исследования биологических объектов. В частности это позволит обеспечить одновременное параллельное выполнение огромного количества экспериментов. В связи с чем неуклонно растет интерес к методам получения характеристик биологических систем на основе чипов. В частности, для задач секвенирования геномов используются микроматричные системы анализа. Микроматрица состоит из лунок, нанесенных на твердую подложку, в каждой из которых находится одна точно заданная молекула. В силу специфики биологического распознавания каждая такая молекула будет связываться только со своим партнером. Т.е. каждая лунка является сенсором для своего партнера. Такая матрица подвергается воздействию анализируемого раствора, после чего определяют, какая лунка соединилась со своим партнером. Обычно для этого используется флуоресцентное сопряжение: матрица сканируется оптическим микроскопом и подсчитываются флуоресцирующие лунки. Преимущество такого метода с точки зрения биологов заключается в том, что он позволяет за одно испытание проверить очень большое количество генов на наличие их в образце ДНК.

Существует множество подходов к изготовлению таких матриц. Рассмотрим один из них. В данном случае олигонуклеотиды синтезируются in situ на твердой подложке с помощью одного из фотолитографических методов. К каждой растущей последовательности присоединены фоторасщепляемые защитные группы. После облучения нужных лунок к находящейся в ней молекуле можно присоединить

76

Биологические сенсоры на основе наноматериалов

следующее нужное основание. Надо отметить, что подобная химия является чрезвычайно чувствительной: даже небольшая погрешность (в несколько процентов) при присоединении какого-то основания сразу приводит к ошибке синтеза протяженной последовательности (допустим из 20 оснований). Другие подходы заключаются в размещении молекул (которыми могут быть не только олигонуклеотиды, но и другие молекулы, например белки) с помощью технологии струйной печати.

Помимо очевидной высокой производительности, эти методы обладают и некоторыми недостатками. Для обеспечения эффективного соединения необходимо оптимизировать взаимодействие образцов с твердой подложкой. Однако в промышленных системах эта проблема сохраняется, что приводит к низкой эффективности гибридизации. Помимо этого сильно ограничена чувствительность методов. В случае ДНК-анализа приходится использовать полимеразную цепную реакцию (ПЦР), с помощью которой добиваются «усиления» образцов. ПЦР создает множественные дубликаты частей ДНК, увеличивая размер образца и тем самым помогая нивелировать низкую чувствительность микроматричного анализа. Однако в случае белков это не проходит. Более того, при анализе белков антитела должны быть закреплены на поверхности твердой подложки, однако не разработано пока признанного метода эффективного обездвиживания антител, так что способностью присоединять свои антигены обладает лишь малый процент антител. Так или иначе, существует противоречие между ограничениями методов, с одной стороны, и потенциальными выгодами, с точки зрения биологов, связанными с их высокой производительностью, с другой стороны.

Существует потенциальная возможность улучшения чувствительности с помощью реализации миниатюрных систем. Возможности, открывающиеся благодаря высокопроизводительному исследованию посредством огромного числа параллельных миниатюризированных экспериментов, привлекают огромный интерес к разработке методов работы с малыми объемами материалов. Быстро растущий интерес наблюдается в отношении микроструйных систем, т. е. миниатюризированных потоковых систем, причем не только в связи с биологическими применениями, но и вообще в связи с методами любого анализа. Концепция «лаборатория на чипе» уже вполне сформировалась и укоренилась. Основная идея, именуемая общим микроанализом, состоит в том, чтобы проводить весь процесс на одном миниатюрном чипе, обычно изготовленном из кремния или из полимера, такого как ПДМС.

77

Биологические сенсоры на основе наноматериалов

Так, например, уже созданы прототипы наносенсоров, способных не только обнаруживать определенные белковые молекулы или отдельные спирали ДНК, но и определять их концентрацию. Во многом это стало возможным благодаря открытию полимеразных цепных ре-

акций (polymerase chain reaction, PCR) - ферментативного метода, по-

зволяющего увеличить концентрацию ДНК с помощью температурноконтролируемых циклических реакций. В реакциях PCR число молекул ДНК удваивается в течение каждого цикла. Сегодня такие устройства уже прошли клинические испытания и используются учеными для определения редких мутаций ДНК при раковых заболеваниях. Лаборатории на чипе позволяют осуществлять экспрессный комплексный анализ крови, определяя наличие и уровень аллергенов к тем или иным препаратам или содержание глюкозы в крови у диабетических больных.

Каждый чип состоит из миниатюрных реакторов, микроканалов для подачи образцов и миниатюрных вентилей, управляющих потоками реагентов. Течение в микроканалах представляет собой довольно интересную техническую задачу. Свойства потока зачастую оказываются зависящими от свободной энергии границы раздела поток— твердая подложка. Этим они отличаются от макроскопических потоков и реакторов, в которых прилегающая к поверхности область составляет пренебрежимо малую часть всего объема. В каналах размерами 10—100 мкм числа Рейнольдса оказываются настолько малы, что течение носит ламинарный характер, при котором слияние нескольких каналов в один поток может происходить без перемешивания. Некоторое перемешивание, конечно, происходит за счет диффузии на границе между потоками, но оно происходит в области, ширина которой гораздо меньше характерных размеров самого канала или клетки. Этот подход был применен для воздействия на разные части клетки разными реагентами. Контроль скорости потока, геометрии каналов, взаимодействия со стенками каналов и коэффициентов взаимодиффузии различных реагентов позволяет в значительной мере управлять составом ламинарного потока, воздействующего на данную клетку. Процесс течения в узких каналах ставит перед конструктором множество технических задач, главная из которых состоит в его организации. Самый очевидный подход состоит в том, чтобы по аналогии с макроскопическими системами приводить поток в движение за счет перепада давлений. Для этого можно использовать миниатюрные насосы. Несколько видоизмененный подход заключается в использовании центробежного потока. При этом микроструйная система вращается таким образом, чтобы жидкость выталкивалась в каналы центробеж-

78

Биологические сенсоры на основе наноматериалов

ной силой. Однако эти подходы обладают одним серьезным недостатком: для управления потоками в очень узких каналах и очень малых объемах необходимо создавать огромные перепады давлений. Когда на стенках канала присутствует поверхностный заряд, можно воспользоваться методом электро-осмоти-ческого потока. Вблизи стенок образуется заряженный слой, обогащенный соответствующими противоионами ионов стенок. Приложение электрического напряжения вдоль стенки приводит этот слой в движение под действием электрического поля. В результате получается конвективное движение.

В микроструйную сеть могут быть включены самые разнообразные устройства анализа и разделения, все вместе они образуют систему полного микроанализа. Разделение является одной из критических операций при анализе биологических систем, которые обычно являются чрезвычайно сложными и состоят из множества различных компонент. Нанотехнологии предоставляют исследователю множество новых средств работы с образцом, в том числе и средств разделения, которые в конечном итоге могут быть интегрированы в любую систему полного микроанализа. Одним из примеров является изготовление одним из литографических методов камер, содержащих массивы кремниевых столбиков, представляющих собой препятствия на пути раствора, протекающего через камеру, содержащего ДНК. Такой массив обладает регулярной и контролируемой структурой, что, в отличие от применяемых в традиционном биологическом анализе гелей, позволяет проводить точное и эффективное разделение молекул ДНК по их молекулярным весам.

С середины 90-х годов стало доступным проведение экспресстестов на большой набор вирусов, токсинов, аллергенов и наркотических препаратов. В настоящее время разработаны системы панельной экспресс-диагностики целого ряда тяжелых заболеваний, таких, как инфаркт миокарда, сердечная недостаточность, ишемия головного мозга, тяжелые токсические состояния. Принцип работы таких систем основывается на определении содержания в крови селективных маркеров того или иного заболевания и на анализе их соотношения. Диагностика осуществляется прямо у постели больного и занимает не более 15 минут. При этом образцы для анализа не требуют предварительной подготовки. Панельные системы могут применяться на ранних стадиях развития заболевания, когда другие методы диагностики (электрокардиография, компьютерная и магнитно-резонансная томография) недоступны или бессильны. Использование панелей дает возможность получать достоверные качественные, полуколичественные, а иногда и количественные результаты в течение нескольких минут,

79

Биологические сенсоры на основе наноматериалов

тем самым давая возможность врачам быстро определиться с тактикой ведения больного и назначить адекватную терапию.

Одна из первых панелей (Triage® Drags of Abuse Panels), выпу-

щенная компанией Biosite в 1992 году, представляла собой маленькую портативную панель, определяющую наличие в моче метаболитов девяти видов наркотических веществ методом иммунохроматографического анализа. Несколько позже, в 1999 г. эта компания создала первый экспресс-тест на белковые молекулы (Triage® Cardiac Panel), а в 2001 г. Biosite сделала следующий шаг, продемонстрировав возможность одновременного определения до 100 белков на одной панели.

Принцип работы диагностических панелей обычно основывается на микрокапиллярной диффузии компонентов в строго детерминированные участки панели, содержащие определенные химические реагенты, взаимодействие с которыми приводит к образованию окрашенных или флуоресцирующих комплексов. В реакционной области, в зависимости от цели исследования, находятся флуоресцентно меченые антитела или антигены, которые связываются с анализируемыми молекулами. Применение методики иммунофлуоресцентного анализа обеспечивает большую специфичность и чувствительность. Увеличение точности часто достигается за счет увеличения числа измерений. Однако методики иммуноабсорбционного и иммунофлуоресцентного экспресс-анализа не лишены недостатков — спектроскопические методы часто дают неточные результаты в случае перекрывания полос поглощения или флуоресценции, а также при опалесценции растворов.

Для решения этой проблемы недавно был предложен метод детектирования биомолекул гибридными наноструктурами на основе композитных пленок пористого кремния, покрытых монослоями антител или молекул, комплиментарных по отношению к определяемым белкам. Этот подход оказался простым и эффективным как с аналитической, так и с экономической точки зрения. Так как молекулы биологически активных веществ можно высокоселективно сорбировать при помощи комплиментарных белков, определение концентрации того или иного компонента в растворе может быть выполнено с помощью непосредственного измерения массы молекул, хемосорбируемых на поверхности резонансных сенсоров, например, кремниевых или пьезокварцевых пластин (кантилеверов) с высокоразвитой поверхностью («молекулярных весов»). При этом захват антителом бактерии, вируса или молекулы патогена приводит к изменению частоты колебаний кантилевера, что позволяет точно определить содержание биологически активного вещества. Уже сейчас возможно не только создать покрытие кантилевера, но и сделать его специфичным по отношению к

80