immunologia_zachet_1

заболевания чаще развиваются у женщин, чем у мужчин.

Диагностика аутоиммунных заболеваний

Общим принципом диагностики аутоиммунных заболеваний является обнаружение аутоантител или сенсибилизированных лимфоцитов, но ситуация осложняется тем, что наличие указанныхфакторов может наблюдаться у здоровых лиц и у пациентов с аутоиммунным процессом без клинического проявления.

Основные критерии диагностики, основанные на доказательстве аутоиммунной природы заболеваний, уже были обсуждены выше. Они, конечно, верны, но воспроизвести их в повседневной работе лаборатории достаточно трудно. Поэтому как бы мы ни относились к аутоиммунитету, аутоантитела безусловно служат маркерами аутоиммунных заболеваний.

Кроме анализа аутоантител, сообщают о достаточной информативности определения СОЭ и С3 и С4 компонентов комплемента для оценки стадии аутоиммунного заболевания (обострение или ремиссия), его активности и эффективности лечения. Определение компонентов комплемента, конкретно С3 и С4 позволяет судить об эффективности лечения многих аутоиммунных заболеваний, например, они снижены при СКВ с поражением почек, поражением ЦНС и гемолитической анемией. Выявление фактора Ва, СЗа, С4а используют в анализе течения РА, СКВ, системной склеродермии.

21)Современные гипотезы развития аутоиммунной патологии.

1.Теория “запретных” клонов. Известно, что при индукции толерантности на определенных этапах развития (созревания) иммунной системы происходит элиминация (разрушение) тех Т- и В-лимфоцитов, которые обладают аутореактивностью – способностью реагировать с ауто (self) – антигенами. Согласно теории “запретных” клонов, по тем или иным причинам в тимусе и костном мозге не происходит полная элиминация аутореактивных Т- и В-лимфоцитов, что в будущем, при стечении определенных обстоятельств, может привести к срыву толерантности.

2.Теория секвестрированных (забарьерных) антигенов. Известно, что определенные ткани ограждены гистогематическими барьерами (половые железы, ткани глаза, мозга, щитовидной железы и др.). В связи с этим при созревании иммунной системы антигены таких тканей не контактируют с лимфоцитами и не происходит элиминации соответствующих клонов клеток. При нарушении гистогематического барьера и попадании антигенов в кровоток собственные иммунокомпетентные клетки распознают их как чужеродные и запускают весь механизм иммунного ответа.

3.Теория расстройства иммунологической регуляции(Поддержание толерантности на периферии).

•Снижение функции Т-лимфоцитов-супрессоров. Считается, что Т-лимфоциты-супрессоры подавляют способность В-лимфоцитов продуцировать антитела против собственных тканей,

поддерживая таким образом состояние толерантности. При снижении количества или функции Т-супрессоров потенциально аутореактивные В-клетки начинают реагировать на собственные тканевые антигены, а появляющиеся аутоантитела приводят к развитию аутоиммунного заболевания.

•Нарушение функции Т-лимфоцитов-хелперов. В частности, при ее повышении могут создаваться условия, благоприятные для инициации ответа со стороны аутореактивных В-лимфоцитов на собственные антигены, даже при нормальной функции Т-супрессоров. Таким образом, потенциальные возможности развития аутоиммунитета, имеющиеся в организме, реализуются за счет нормально функционирующих иммунологических регуля-торных механизмов, включающих, прежде всего. Т-лимфоциты – супрессоры и хелперы.

•В последние годы все большую популярность приобретает гипотеза, согласно которой в основе аутоиммунной патологии лежат расстройства иммунной регуляции, обусловленные нарушением продукции соответствующих цитокинов Т-лимфоцитами-хелперами I и II типов, а также Т-регуляторными клетками.

•Игнорирование – объясняется отсутствием (или недостаточностью) презентации антигена, либо отсутствием Т-клеток с рецептором для соответствующего антигенного пептида, находящегося

вбороздке молекулы ГКГ. Эти так называемые «дыры» в репертуаре Т-клеток, которые объясняются тем, что в раннем периоде созревания толерантности соответствующие клоны

ауто-реактивных Т-клеток подверглись в тимусе клональной делеции.

•Анергия – объясняется отсутствием ко-стимуляционных сигналов. В этом случае Т-клетка своим антиген-распознающим сигналом распознает антиген в бороздке молекулы ГКГ, но поскольку отсутствует дополнительный ко-стимуляционный сигнал, такая Т-клетка подвергается апоптозу.

•Регуляци я – объясн яется су ществованием специа льных рег ул яторных Т-клеток (T-reg), которые способны за счет цитокинов TGF и ИЛ-10 подавлять функцию Т-хелперов 1 и Т-хелперов 2

типов. Кроме того, на поверхности T-reg имеется молекула CTLA4, которая, связываясь с молекулой СД80/86 на поверхности АПК, препятствует связыванию последней с молекулой СД28 на поверхности Т-лимфоцита, блокируя таким образом ко-стимуляционный сигнал. В свою очередь, молекула CTLA4 через молекулу СД80/86 передает обратный сигнал в антиген-презентирующую клетку, повышая в ней экспрессию фермента индоламин-2,3-диоксигеназу, которая уменьшает количество триптофана в Т-лимфоците, подавляя таким образом его активность.

4.Теория нарушения идиотип-антиидиотипических взаимодействий.

Современные модели иммунного ответа предполагают, что иммунная система обладает саморегулировкой и может реагировать на свои собственные продукты с последующей супрессией или стимуляцией этой реакции. Известно, что в сыворотке крови больных и здоровых лиц можно обнаружить антитела против собственных Ig (первым антителом такого типа, обнаруженным у человека, был ревматоидный фактор). Идиотипическая детерминанта (идиотип) тесно связана с индивидуальной структурой активного центра молекулы Ig. Вначале считалось, что продукция аутоантител против собственных Ig – результат нарушения процесса распознавания “своего”, и это является либо причиной, либо симптомом

заболевания. Однако впоследствии многие исследователи обнаружили антииммуноглобулины в сыворотке крови здоровых лип, исходя из чего предположили, что продукция антииммуноглобулинов представляет собой физиологический, а не патологический процесс. На этой основе была разработана модель иммунной системы, в которой контрольно-регуляторные влияния зависят от множества взаимодействующих компонентов, а антииммуноглобулины, направленные против активного центра молекулы специфического антитела (антиидиотипические антитела) играют ведущую роль. Было сделано предположение (N. К. Erne, 1974), что распознавание идиотипических детерминант и развитие антиидиотипического иммунного ответа представляет собой центральный механизм контроля и регуляции биосинтеза антител. Эта теория получила название сетевой теории регуляции иммунного ответа.

Втеории Ерне можно выделить два основных положения:

•Иммуноглобулины, а также иммуноглобулиновые рецепторы на поверхности антиген-реактивных Т- и В-лимфоцитов имеют детерминанты, обладающие (ауто-) антигенными свойствами, и

получившие название “идиотип” (идиотипические детерминанты);

•В организме предсуществуют лимфоциты, способные в норме распознать своими рецепторами идиотипические детерминанты и реализовать антиидиотипический ответ. Анти-идиотипическое антитело также может быть распознано и на него вырабатываются анти-антиидиотипические антитела до тех пор, пока иммунный ответ не угаснет. Полагают, что идиотип и анти-антиидиотип являются идентичными структурами.

5.Теория поликлональной активации В-лимфоцитов. Обнаружено, что многие вещества химической или биологической природы обладают способностью индуцировать активацию В-лимфоцитов, которая приводит к их пролиферации и продукции антител. Как правило, такие антитела относятся к иммуноглобулинам класса М. В том случае, если поликлональной активации подверглись аутореактивные В-лимфоциты, продуцирующие аутоантитела, возможно развитие аутоиммунного заболевания.

6.Теория развития аутоиммунитета под влиянием суперантигенов.

Бактериальные суперантигены получили свое название в связи со способностью активировать большое количество Т- и В-лимфоцитов независимо от антигенной специфичности этих клеток. При классическом варианте антигенного распознавания Т-хелпер активируется под влиянием взаимодействия Т-клеточного антигенраспознающего рецептора (ТАГРР) и пептида, который презентируется антигенпредставляющей клеткой (АПК) в ассоциации с молекулой главного комплекса гистосовместимости класса II. При этом только один (или несколько) Т-лимфоцитов-хелперов могут быть активированы. Активация Т-лимфоцитов-хелперов под влиянием суперантигенов происходит совсем по-другому. В этом случае суперантиген не поглощается антигенпредставляющей клеткой и не подвергается обычному перевариванию (процессингу) с образованием пептида. При этом суперантиген как бы обходит этот необходимый для специфического распознавания этап и неспецифически связывается с вариабельной частью бета-цепи Т-клеточного распознающего рецептора вне его антигенспецифической зоны (сайта). Происходит своеобразное перекрестное связывание молекул главного комплекса гистосовместимости антигенпрезентирующей клетки с Т-клеточным распознающим рецептором. В случае такого механизма активации Т-лимфоцитов-хелперов возможна одновременная активация большого их количества.

Рассматриваются три возможных механизма участия суперантигенов в развитии аутоиммунных нарушений.

A.Активация аутореактивных Т-лимфоцитов. Доказано, что суперантигены могут непосредственно активировать аутореактивные Т-лимфоциты, которые затем мигрируют в соответ ствующие ткани и вызывают аутоиммунные нарушения, продуцируя цитокины и/или реализуя свою киллинговую функцию.

Б.Активация аутореактивных В-лимфоцитов. Осуществляется за счет того, что суперантиген связывает молекулы комплекса HLA класса II, имеющиеся на В-лимфоцитах, с молекулой Т-клеточного антигенраспознающего рецептора. В этом случае активация Т-лимфоцитов происходит без специфического распознавания антигена, а неспецифически под влиянием суперантигена. Тем не менее, такой Т-лимфоцит продуцирует соответствующие цитокины, которые способствуют тому, что активированный аутореактивный В-лимфоцит начинает продуцировать аутоантитела. Последние образуют иммунные комплексы и, оседая в тканях, вызывают их повреждение. Не исключается, что В-лимфоциты могут активироваться и через собственный ан-тигенраспознающий иммуноглобулиновый рецептор.

B.Активация антигенпредставляющих клеток. Суперантигены могут активировать антигенпредставляющие клетки, например макрофаги. Это приводит к высвобождению из них цитокинов, супероксидных анионов и других медиаторов воспаления. Активация макрофагов может также привести к нарушению переваривания (процессинга) антигенов с последующей презентацией аутоантигенов аутореактивным Т-лимфоцитам.

7.Теория генетической предрасположенности. Согласно современным данным, существует генетически детерминированная предрасположенность к развитию аутоиммунных заболеваний. Эта предрасположенность контролируется по меньшей мере шестью генами, расположенными на разных хромосомах. Часть из них расположена в главном комплексе гистосовместимости (HLA) человека, роль которого в реализации иммунного ответа является первостепенной.

8.Теория молекулярной мимикрии. Термин “мимикрия” в свое время был предложен для объяснения подобия, идентичности антигенных детерминант некоторых микроорганизмов антигенным детерминантам хозяина, в связи с чем их распознавание иммунной системой не происходит, что и обусловливает развитие инфекционного заболевания.

22)Основные принципы иммунотерапии.

Основные задачи иммунотерапии:

-Повышение сниженной иммунореактивности;

-Угнетение повышенной иммунореактивности при аллергии;

-Замещение недостающих факторов иммунореактивности.

Решить основные задачи иммунотерапии можно используя специфические и неспецифические средства. С учетом особенностей и механизмов действия средств выделяют 5 подтипов этой терапии. В связи с особенностями иммунотерапии различных заболеваний необходимо выделить следующие ее группы:

-Иммунотерапия заболеваний с повышенной иммунореактивностью;

-Иммунокоррекция первичных и вторичных иммунодефицитов;

-Иммунотерапия опухолей и лимфопролиферативных заболеваний;

-Иммунотерапия посттрансплантационых реакций;

-Иммунокоррекция нарушений репродукции.

Иммунотерапия может быть местной, общей, комбинированной и монотерапией.

Общая терапия - когда препарат вводимый в организм равномерно действует на всю лимфоидную ткань.Местная терапия (регионарная) - лечение на очаг поражения - электрофорез, ингаляция,

промывание. Целесообразность такого применения обусловлена уменьшением резорбтивного общего или токсического действия и наибольшим влиянием на местные факторы иммунитета,

которые нередко играют ведущую роль в прекращении патологического процесса. Комбинированная терапия - включает применение нескольких препаратов, действующих на разные звенья иммунитета и сочетание разных способов общего и местного воздействия. Успешная иммунотерапия невозможна без применения иммунодиагностики, которая позволяет коррегировать лечение,

если оно недостаточно эффективно.

Специфическая иммунотерапия - когда используются препараты антигенов или антитела специфические по отношению к возбудителю или аллергену.

Неспецифическая иммунотерапия, когда используются другие воздействия на иммунную систему, включая химические и физические факторы.

По механизму действия различают активную, когда иммунная система активно отвечает на введенный препарат (антиген, вакцина) и пассивную, когда в организм вводятся готовые защитные факторы - антитела в виде антисывороток или иммуноглобулинов.

В настоящее время недостаточно средств, которые избирательно действуют на определенные звенья иммунной системы. То или иное терапевтическое средство назначается на основании определения характера нарушений иммунореактивности. При необходимости иммуностимуляции или иммуносупрессиии необходимо предварительно испытать назначаемые средства путем кожных проб или в тестах in vitro на эффективность для данного больного. Это позволяет прогнозировать эффективность препарата и избежать осложнений.

Иммуномодулирующие препараты могут действовать на разные стадии иммунного ответа - пролиферацию клеток, на взаимодействие лимфоцитов с клетками-мишенями, на выделение ими медиаторов. Наиболее эффективно применение препаратов, действующих на 1 фазу.

Клиническими критериями выбора иммуностимулирующей терапии принято считать: низкую эффективность лечения основного заболевания (воспалительного процесса) общепринятыми средствами; лечение высокими дозами иммунодепрессантов, длительную кортикостероидную и антибактериальную терапию; хроническую гнойную инфекцию. Иммунологическими критериями

(при наличии клинических признаков иммунодефицита):- снижение содержания и нарушение функциональной активности лимфоцитов, уровня сывороточных иммуноглобулинов, комплемента,

активности фагоцитоза (незавершенность фагоцитоза) не менее чем на 30-50%.

Клиническими критериями выбора иммуносупрессирующей терапии считаются -тяже-лые формы аллергии с поражением почек, трансплантация органов и тканей. Иммунологическими критериями

- -появление в крови в высоких титрах аутоантител.

23)Метод выделения мононуклеарных клеток из периферической крови человека.

Простой подход к выделению лимфоцитов (в связи с возможностью примесей выделяемые клетки обычно называют мононуклеарами) основан на центрифугировании порций крови на слое смеси полисахарида фиколла и радиоконтрастного вещества верографина (другие наименования — гипак, пак); при этом эритроциты и сегментоядерные клетки, а также большинство моноцитов проходят этот слой и оседают на дно пробирки, а лимфоциты с примесью дендритных клеток и моноцитов формируют кольцо над плотным слоем фиколла-верографина.

24)Проточная цитофлюориметрия. Принцип метода, возможности использования.

Это метод исследования дисперсных сред в режиме поштучного анализа элементов дисперсной фазы по сигналам светорассеяния и флуоресценции.

Метод проточной цитофлуорометрии зародился благодаря созданию прибора — лазерного проточного цитофлуориметра, позволяющего регистрировать с помощью лазерного луча параметры клеток, проходящих через капилляр. Параметры регистрируются автоматически и подвергаются компьютерной обработке, результаты которой визуализируются в виде графиков. Метод позволяет исследовать

параметры, основанные на светорассеянии — прямом (размер клетки) и боковом (зернистость). На основании этих параметров строится двумерное распределение клеток, в котором может быть задана область (соответстующая клеткам конкретных типов, локализация которых в этом поле известна). Дальнейший анализ строится на выявлении связанных с клетками флуоресцентных красителей. Краси телями метят моноклональные антитела или иные реагенты, поз-

воляющие определять маркерные молекулы на поверхности клетки (а при дополнительной обработке клеток — и внутри нее). В зависимости от числа лазеров, которым снабжен прибор, варьирует число дифференцируемых цветов (в современных приборах >10). Метод позволяет идентифицировать различные типы клеток, оценить плотность экспрессии маркера и другие многочисленные параметры. На этом же принципе основано фракционирование клеток, экспрессирующих определенные молекулы.

25.Иммуноферментный анализ.

Иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)

— лабораторный иммунологический метод выявления антигенов и антител, основанный на определении комплекса «антиген-антитело» за счет введения в один из ком-понентов реакции ферментативной метки с последующей ее детекцией с помощью соответствующего субстрата, изменяющего свою окраску.

Основой проведения любого варианта ИФА служит определение продуктов ферментативных реакций при исследовании тестируемых образцов в сравнении с негативными и позитивными контролями. Различают несколько десятков модификаций ИФА:

1. ELISA (enzyme linked immunoadsorbent assay) - метод определения с помощью иммуносорбентов, связанных с ферментами;

2.EIA (enzyme immunoassay) - метод на основе фермент-иммуноопределения;

3.EMIT (enzyme multiplied immunoassay technique) - способ, основанный на связи с ферментами. ELISA и EIA - это методы гетерогенного или твердофазного анализа (тИФА), EMIT явля-ется гомогенным ИФА. Для определения антигенов и антител применяются твердофазный (гетерогенный) вариант иммуноферментного анализа. Использование твердой фазы позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и удаления субстанций, не участвующих в реакции. тИФА основан на двух принципиальных научных открытиях. Первое заключается в способности энзимов и антител, ковалентно или нековалентно связанных с твердой осно-вой, сохранять свою функциональную активность, т.е. расщеплять субстрат (ферменты) и связывать антигены/антитела; второе базируется на создании комплекса антитело-фермент (Аb-F) в виде конъюгата, сохраняющего свою биологическую активность в растворе. Аb-F- конъюгаты характеризуются высочайшей специфичностью и чувствительностью, достигающей 97-99%.

Иммунохимические методы анализа, основанные на специфическом связывании определяемого соединения соответствующими антителами, широко вошли в аналитическую практику и используются в различных областях медицины, сельского хозяйства, микробиологической и пищевой промышленности, для целей охраны окружающей среды. Индикация образующегося комплекса антиген-антитело может быть осуществлена, если в один из исходных компонентов реакционной системы ввести метку, которая легко детектируется соответствующим высокочувствительным физико-химическим методом. Весьма удобными для этой цели оказались изотопные, ферментные, флуоресцентные, парамагнитные и др. метки, использование которых дало возможность увеличить чувствительность классических иммунохимических методов анализа в миллионы раз, а время анализа уменьшить до нескольких минут.

Иммуноферментный анализ по сравнению с другими методами детекции антигенов и антител обладает следующими преимуществами: — высокой чувствительностью, позволяющей выявлять концентрации до 0,05 нг/мл. Такая чувствительность метода определяется способностью одной молекулы фермента катализировать превращение большого числа молекул субстрата; — возможностью использовать минимальные объемы исследуемого материала; — стабильностью при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА (до года и более); — простотой проведения реакции; — наличием как инструментального (в качественном и количественном варианте), так и визуального учета; — возможностью автоматизации всех этапов реакции — относительно низкой стоимостью диагностических наборов. Благодаря своей

невысокой стоимости и экологической безопасности, тИФА перешел в разряд стандартных, «рутинных» анализов.

Методы иммуноферментного анализа.

Первичным процессом в иммуноферментном (или иммунохимическом) анализе является ста-дия «узнавания» анализируемого соединения специфическим к нему антителом. Так как процесс образования иммунохимических комплексов происходит в строго количественном соотношении, обусловленном аффинностью, концентрациями компонентов и условиями реакции, то достаточным для определения исходной концентрации анализируемого соединения является количественная оценка образовавшихся иммунных комплексов. Для такой оценки возможно либо прямое определение концентрации образующихся иммунокомплексов (тип 1), либо количественная оценка оставшихся свободными мест специфического связывания (тип 2). Второй общей стадией любого метода иммуноферментного анализа является формирование связи меченного ферментом соединения со специфическим комплексом или свободными центрами связывания. И наконец, заключительным обязательным процессом в иммуноферментном анализе является трансформация ферментной метки в соответствующий сигнал, измеряемый каким-либо физико-химическим методом (спектрофотометрическим, флуориметрическим, люминесцентным и т.д.), что достигается путем измерения скорости превращения субстрата или количества продукта, образующегося за фиксированный промежуток времени. Принимая во внимание вышеописанные подходы для определения специфических комплексов, дальнейшую классификацию методов иммуноферментного анализа, можно осуществить по типу реагентов, используемых на первой стадии анализа. Если на первой стадии в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические анатитела), то метод является неконкурентным. Для неконкурентного анализа типа 1 оптимальным является соотношение компонентов, при котором концентрация центров связывания значительно превышает концентрацию определяемого соединения. Необходимым условием для неконкурентного анализа типа 2 является соблюдение соотношения избытка или сравнимой концентрации определяемого соединения (антигена) и мест специфического связывания, так как в этом случае определяется разность общего числа мест связывания и числа образовавшихся иммунных комплексов. Если на первой стадии анализа в системе одновременно присутствуют анализируемое соединение и его аналог (меченное ферментом анализируемое соединение или анализируемое соединение, иммобилизованное на твердой фазе), конкурирующие за имеющиеся в относительном недостатке центры специфического связывания, то метод является конкурентным. Необходимым условием конкурентного метода является недостаток центров специфического связывания по отношению к суммарной концентрации анализируемого соединения и его аналога. Следующим принципом классификации методов иммуноферментного анализа является их разделение по типу проводимых на каждой из иммунохимических стадий реакций. В соответствии с этим все методы можно разделить на две группы – гомогенные и гетерогенные. В настоящее время разработаны различные варианты твердофазного иммуноферментного анализа:

1. “Сэндвич”-метод. Общая схема проведения метода заключается в следующем. На твердой фазе адсорбированы антитела к исследуемому антигену. После инкубации исследуемого материала и образования комплекса «антитело — антиген» проводится удаление несвязавшихся компонентов, добавляется конъюгат, т.е. антитела к искомому антигену, меченые ферментом. По завершении инкубации, с последующим удалением непрореагировавшего коньюгата промывкой, образуется комплекс, в котором антиген как бы заключен между двумя слоями антител. Наличие меченных ферментом антител определяется при помощи соответствующего субстрата.

“Сэндвич”-метод используется для выявления HBsAg, HBeAg, антигена вируса гепатита А.

2.Непрямой ИФА. На твердой фазе иммобилизуют антиген, после инкубации исследуемого материала и удаления несвязавшихся компонентов добавляют меченые ферментом антитела к иммуноглобулинам человека класса IgG, которые взаимодействуют с Fc-фрагментом к IgG. После проведения субстрат-ферментативной реакции проводят учет полученных результатов. При наличии антител уровень оптической плотности прошедшей реакции превосходит показатели отрицательных образцов. Этот метод применяется для определения антител к вирусу гепатита С.

3.Конкурентный метод. К антигену, иммобилизованному на твердой фазе одновременно добавляют исследуемый материал и конъюгат. При проведении реакции меченные и исследуемые антитела конкурируют за активные центры антигена, иммобилизованного на твердой фазе. После завершения инкубации и удаления не прореагировавших компонентов проводится ферментативная реакция, результаты которой обратно пропорциональны количеству антител в исследуемом образце.

4.Ингибирующий ИФА. На полистироловом шарике адсорбирован стандартный АГ, после инкубации с исследуемым материалом и удаления непрореагировавших компонентов добавляется АГ, меченный ферментом, который взаимодействует со свободными центрами связывания антител , провзаимодействовавшими с антигеном, сорбированным на твердой фазе. При наличии антител в исследуемой пробе уровень оптической плотности прошедшей реакции превосходит показатели отрицательных контрольных образцов.

5.Прямой ИФА. На первом этапе реакции исследуемый образец фиксируют на твердой фазе. Затем к нему добавляют конъюгат. После удаления непрореагировавших компонентов реакции проводится ферментативная реакция, интенсивность которой прямо пропорциональна содержанию исследуемых антигенов в образце и вообще говорит об их наличии в исследуемом материале.

Гомогенный ИФА .К гомогенным относятся методы, осуществляемые в однофазной системе, и не требующие стадии механического разделения образовавшихся комплексов. Во всех схемах проведения гомогенного иммуноферментного анализа регистрируется концентрация не образующегося специфического комплекса антитело-антиген, а оставшихся свободными центров специфического связывания. Однако, в противоположность гетерогенным схемам, наблюдаемая ферментативная активность, соответствующая концентрации незанятых мест специфического связывания, может как уменьшаться, так и увеличиваться, что обусловлено различной природой воздействия связывания лигандов на ферментативную активность. Введение метки в молекулу антигена является одним из наиболее распространенных подходов в гомогенных методах иммуноферментного анализа. Все гомогенные методы относятся к конкурентным и основаны на одновременном взаимодействии с антителами анализируемого и меченого антигенов. После образования в растворе соответствующего иммунохимического комплекса проводят измерение ферментативной активности, которая пропорциональна концентрации свободного или связанного меченого лиганда.

Антитело, образуя комплекс с антигеном, подавляет активность связанного фермента.

Комплекс Аг-Е, подобно свободному E, катализирует превращение субстрата S в продукт реакции P: S ---- P, тогда как комплекс Ат-Аг-Е теряет активность: S ----* P

Потеря активности может быть вызвана изменением конформации молекулы фермента, ведущим к нарушению структуры его активного центра. Другая причина - фермент не может

проявить активность, поскольку антитело закрыло доступ субстрата к активному центру фермента.

Если добавить свободный антиген, то он, конкурируя за Ат, вызывает регенерацию Аг-Е и появляется активность фермента:

а(Ат-Аг-Е) + bАг = с(Ат-Аг-Е) + d(Ат-Аг) + е(Аг-E) + fAг

При наличии калибровочной кривой, построенной с применением известных концентраций меченого и немеченого антигена (график будет представлять собой линейную зависимость между концентрацией Аг и ферментативной активностью Аг-Е), таким методом (конкурентного, гомогенного ИФА) можно определить концентрацию антигена в исследуемом образце.

Наряду с ферментами, в гомогенном ИФА в качестве метки могут быть использованы модуляторы (М) ферментов - вещества, способные подавлять или стимулировать активность ферментов: Ат + (Аг-М-Е)= (Ат-Аг-М-Е), Ат + Аг =(Ат-Аг), S ---- P, S ----* P

Комплекс Аг-М-Е каталитически активен, а будучи связанным с Ат, неспособен катализировать реакцию. Свободный Аг, находящийся в тестируемом образце, конкурируя с Аг-М-Е за связывание с Ат, добавленным в лимитированном количестве, ведет к увеличению концентрации Аг-М-Е и тем самым способствует протеканию ферментативной реакции. Это вариант с положительным модулятором фермента. Напротив, с отрицательным модулятором активность фермента будет снижаться по мере возрастания свободного Аг в тестируемом образце.

Существует много других модификаций гомогенного ИФА. Назовем еще три из них:

- применение в качестве метки простетической группы ферментов, ковалентно связанной с Аг;

-применение комплексов флуорогенных субстратов (S) фермента с Аг (в отличие от Аг-S комплекс Ат-Аг-S не может служить субстратом фермента, в результате ферментативной ре-акции образуется интенсивно флуоресцирующий продукт);

- применение антител, которые, связываясь с активным центром фермента, ингибируют его активность. Время, за которое проводится гомогенный ИФА, не превышает 5 мин.

Хотя гомогенному ИФА присущи быстрота и малая трудоемкость, он характеризуется более низкой чувстви-тельностью в сравнении с гетерогенным ИФА.

Применение ИФА: Чувствительность ИФА такова, что определение веществ в концентрациях 1,0 – 0,001 нМ или белка в микрограммах-нанограммах в 1 мл - это обыденное дело. Подобно тому, как глаз человека регистрирует одиночный световой квант, ИФА можно усовершенствовать так, что он с помощью каскадных систем усиления позволит обнаруживать одиночные молекулы анализируемого вещества. Возможности увеличения чувствительности ограничиваются фоном анализируемого соединения, (то есть его наличием не только в анализируемом образце, но и в используемых реактивах и растворителях), субстратной специфичностью фермента и аффинностью антител. К ограничениям ИФА относится также наличие в тестируемых образцах кофакторов, ингибиторов и стимуляторов активности ферментов. Еще один недостаток - ИФА не позволяет различать нативные белки и их биологически неактивные фрагменты, сохранившие антигенные детерминанты. Помехой для ИФА может быть изменение каталитической активности фермента при его конъюгировании с антигеном. Ограничением ИФА является его применимость лишь к хорошо изученным системам, где есть очищенные антигены и высокоспецифические антитела. В основном метод применяется для диагностики сифилиса ( в комплексе с другими

реакциями), ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов. Имеет ограниченное значение для диагностики хламидийной инфекции, цитомегаловирусной инфекции и других герпетических инфекций. Метод ИФА используется также для определения антител при различных инфекционных заболеваниях, уровня гормонов, аутоантител и различных маркеров онкологических заболеваний, возможно определение иммуноглобулинов (видовая принадлежность, субклассы, специфичность), а также субпопуляционная идентификация лимфоцитов. Однако следует отметить, что иммуноферментный анализ может давать и ложные результаты. Ложноположительные могут возникнуть за счет ревматоидного фактора, представляющего собой иммуноглобулин M против собственных иммуноглобулинов G человека; за счёт антител, образующихся при различных системных заболеваниях, нарушениях обмена или приёме лекарственных препаратов; у новорожденных такие ложноположительные реакции могут возникать за счёт образования в организме ребёнка M-антител к иммуноглобулину G матери. Ложноотрицательные результаты реакции обусловлены конкуренцией между иммуноглобулинами М и G, а также техническими ошибками при постановке реакции.

26. ПЦР:принцип метода, возможности применения

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, который представляет собой специфическую амплификацию нуклеиновых кислот, индуцируемую синтетическими олигонуклеотидными праймерами in vitro.

Идея разработки метода ПЦР принадлежит американскому исследователю Kary Mullis, который в 1983 г. создал метод, позволивший амплифицировать ДНК в ходе циклических удвоений с помощью фермента ДНК-полимеразы в искусственных условиях. Через несколько лет после опубликования этой идеи, в 1993 г., К. Mullis получил за нее Нобелевскую премию.

Суть метода. Метод основан на многократном избирательном копировании определенного участка ДНК при помощи фермента Taq-ДНК-полимеразы. Полимеразная цепная реакция позволяет получить амплификаты длиной до нескольких тысяч пар нуклеотидов. Для увеличения длины ПЦР-продукта до 20—40 тыс. пар нуклеотидов применяют смесь различных полимераз, но все равно это значительно меньше длины хромосомной ДНК эукаротической клетки.

Реакция проводится в программируемом термостате (амплифи-каторе) — приборе, который может проводить достаточно быстро хлаждение и нагревание пробирок (обычно с точностью не менее 0,1 °С). Амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта» и последующего хранения. Для ПЦР в режиме реального времени выпускают приборы, оборудованные

флуоресцентным детектором. Существуют также приборы с автоматической крышкой и отделением для микропланшет, что позволяет встраивать их в автоматизированные системы.

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20-45 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий: денатурации, отжига прай-меров, элонгации

Области применения

Метод ПЦР применяется для выявления в клинических образцах вирусов, микобактерий, простейших и бактерий, для обнаружения врожденных и приобретенных генетических нарушений, а также для идентификации личности. Сфера применения ПЦР в диагностике будет постепенно расширяться, поскольку в клинической практике все чаще имеют дело с очень небольшими по размеру биоптатами, получаемыми, например, при эндоскопических исследованиях; или это тонкоигольные аспираты и т.д. В подобных случаях

обычный гистологический анализ затруднен. Перечислим, для чего может служить ПЦР.

В иммунологических исследованиях ПЦР чаще всего используется:

•для определения полиморфизма генов, белковые продукты которых участвуют в иммунологических реакциях;

•для определения экспрессии цитокинов, рецепторов цитокинов и других эффекторных молекул;

•для ДНК типирования HLA аллелей и др.

ДНК, выделенную из лимфоцитов, анализируют следующими вариантами ПЦР.

1.ПЦР-праймер со специфической последовательностью (PCR-SSP).

2.ПЦР-олигонуклеотидные пробы со специфической последовательностью (PCR-SSOP).

3.ПЦР-рестрикционный анализ продуктов амплификации (PCR-RFLP).

4.ПЦР-метод обратной гибридизации амплифицированного фрагмента с олигонуклеотидными зондами,

фиксированными на мембране или другой твердой подложке (пластине).