Занятие № 7. «Ферментативный катализ»

Цель занятия: изучить метод количественного определения активности ферментов.

ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ:

1. Методы определения ферментативной активности. Единицы измерения активности и количества фермента.

2. Механизмы регуляции ферментативной активности.

3. Механизм ферментного катализа. Фермент-субстратный комплекс. Каким образом ферменты снижают энергию активации химических реакций?

4. Коферменты, образующиеся из витаминов В₁, Н. Механизм действия ферментов карбоксилирования и декарбоксилирования.

5. Коферменты, образующиеся из витаминов В₂, В₅, липоевая кислота и их биохимическая роль. Механизм действия окислительно-восстановительных ферментов (оксидоредуктаз).

6. Коферменты, образующиеся из витаминов В₃, В₁₂, В₆, Вс и их биохимическая роль. Механизм действия ферментов трансфераз.

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

Экспериментальная работа. Опыт 1. Определение активности амилазы (диастазы) мочи по Вольгемуту.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2. Набор пипеток.

3. Водяная баня.

Реактивы. 1. 0,85%-ный раствор хлорида натрия.

2. Моча.

3. Крахмал, 0,1%-ный раствор.

4. Реактив Люголя.

Принцип метода: Определение активности амилазы в биологических жидкостях (моча, сыворотка крови, слюна) основано на нахождении наименьшего количества фермента, необходимого для полного расщепления добавленного крахмала в стандартных условиях.

Амилазная активность мочи выражается количеством миллилитров 0,1% раствора крахмала, которое расщепляется ферментом, содержащимся в 1 мл неразведенной мочи, при температуре 45⁰С за 15 минут.

В норме моча человека содержит мало амилазы, происходящей из поджелудочной железы. Активность амилазы (диастазы) мочи обозначается А450 (или d450). В норме активность амилазы мочи равна 16-64 ед.

Определение активности амилазы в моче и сыворотке крови широко используется в клинической практике с целью диагностики заболеваний поджелудочной железы. При острых панкреатитах амилазная активность мочи и сыворотки крови увеличивается в десятки раз, особенно в первые сутки заболевания, а затем постепенно возвращается к норме. При почечной недостаточности амилаза в моче отсутствует.

1. Пронумеруйте 10 пробирок. В каждую налейте по 1 мл 0,85% раствора хлорида натрия.

2. В первую пробирку налейте 1 мл исследуемой мочи, перемешайте, 3 раза втяните смесь в пипетку и выпустите ее в пробирку.

3. 1 мл раствора перенесите во вторую пробирку, перемешайте, 3 раза втяните смесь в пипетку и выпустите ее в пробирку.

4. 1 мл раствора перенесите в третью пробирку и т.д.

5. Из последней пробирки 1 мл смеси вылейте.

6. Во все пробирки добавьте по 1 мл 0,85% раствора хлорида натрия.

7. Начиная с десятой пробирки, добавьте во все пробирки по 2 мл 0,1%-ного раствора крахмала, перемешивая при этом содержимое всех пробирок.

8. Все 10 пробирок одновременно поставьте на 15 минут в водяную баню (45⁰С, не допускать превышения температуры!).

9. Через 15 минут охладите пробирки под краном и в каждую добавьте по 2 капли реактива Люголя (раствора йода).

10. Результаты эксперимента занесите в таблицу:

Номер пробирки	Степень разведения мочи	Окраска содержимого пробирки после добавления реактива Люголя
1	1:2
2	1:4
3	1:8
4	1:16
5	1:32
6	1:64
7	1:128
8	1:256
9	1:512
10	1:1024

11. Для подсчета активности амилазы мочи учитывают ту пробирку, в которой уже нет синего оттенка (т.е. пробирка с желтой окраской).

Расчёт: Предположим, что полное расщепление крахмала произошло в первых четырёх пробирках. В четвёртой пробирке разведение мочи 1:16. Следовательно: ¹/₁₆ мл мочи расщепила 2 мл 0,1% раствора крахмала, 1 мл неразведенной мочи расщепит Х мл 0,1% раствора крахмала.

Следовательно, активность амилазы (диастазы) мочи равна 32 ед.

Опыт 2. Изучение активности каталазы крови иммобилизованной на активированном угле.

Данная работа является простейшим способом доказательства того, что ферменты после иммобилизации, при соответствующих условиях среды, не теряют свою каталитическую активность.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2. Набор пипеток.

3. Центрифуга.

4. Ступки.

Реактивы. 1. Уголь активированный, таблетки.

2. Кровь.

3. Физраствор.

4. Перекись водорода, 3%-ный раствор.

Реактивы, оборудования: таблетки активированного угля, свежевзятая кровь, физиологический раствор, 2%-й раствор перекиси водорода, ступки, центрифуга.

1. Возьмите 2 таблетки активированного угля и разотрите их в ступках.

2. В одну из ступок добавьте 3 капли крови и еще раз разотрите.

3. После 10 минутной адсорбции фермента эритроцитов крови на активированном угле перенесите содержимое обеих ступок в центрифужные пробирки.

4. В обе пробирки добавьте по 2 мл физиологического раствора, перемешайте и центрифугируйте в течение 5 минут при 1000 об/мин.

5. После этого выньте пробирки из центрифуги, слейте надосадочную жидкость.

6. В осадок добавьте примерно по 1 мл раствора перекиси водорода.

7. Объясните полученные результаты.