Занятие № 20. «Белковый обмен (часть 2)»
Цель занятия: изучить метаболизм аминокислот.
ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ:
Механизм реакций трансаминирования. Биологическая роль данного процесса.
Пути декарбоксилирования аминокислот. Биологическое значение конечных продуктов этих реакций
Дезаминирование аминокислот. Биологическое значение конечных продуктов этих реакций.
Роль ароматических аминокислот в метаболизме.
Роль серосодержащих аминокислот в метаболизме.
Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________
Экспериментальная работа.
Опыт 1. Расщепление белка под действием щелочи.
Приборы. 1. Штатив с пробирками.
2. Набор пипеток.
3. Газовая горелка.
4. Держатель для пробирок.
Реактивы. 1. Яичный белок, 30%-ный раствор.
2. Желатин, 30%-ный раствор.
3. Гидроксид натрия или калия, 30%-ный раствор.
4. Ацетат свинца, 10%-ный раствор.
В пробирку налейте 1-2 мл 30%-ного раствора яичного белка.
Добавьте двойной объем концентрированного раствора щелочи и кипятите смесь в течение 2-3 мин. При этом выпадает осадок (иногда незначительный), растворяющийся при дальнейшем кипячении, и выделяется аммиак.
К полученному горячему сильнощелочному раствору добавьте 1 мл раствора ацетата свинца и снова кипятите смесь; образующийся сначала белый осадок гидроксида свинца растворяется в избытке щелочи. Если белок при действии щелочи отщепляет серу, то образуется сульфид свинца, в результате чего прозрачная жидкость постепенно окрашивается в коричневый цвет; при относительно высоком содержании отщепляемой серы выпадает темно-коричневый или черный осадок сульфида свинца.
Повторите пункт 1-3 с раствором желатина.
Объясните полученные результаты и наблюдавшиеся эффекты.
Опыт 2. Количественное определение активности аланинаминотрансферазы (АлАТ) в сыворотке крови.
Аминотрансферазы или трансаминазы катализируют межмолекулярный перенос аминогруппы с аминокислот на кетокислоты. АлАТ катализирует реакцию переаминирования между аланином и -кетоглутаровой кислотой. По количеству образовавшейся пировиноградной кислоты можно судить об активности фермента. Количество пировиноградной кислоты определяется колориметрическим путем по цветной реакции с 2,4-динитрофенилгидразином, при которой развивается красно-бурое окрашивание.
В две пробирки внесите реактивы согласно следующей таблице:
Контрольная проба
Опытная проба
Реагент 1 (АлАТ, субстрат), мл
0,25
0,25
Дистиллированная вода, мл
0,05
–
Сыворотка, мл
–
0,05
Перемешать и инкубировать 30 мин
Реагент 2
(динитрофенилгидразин), мл
0,25
0,25
Перемешать и оставить при комнатной температуре на 20 мин
NaOH (С = 0,4 моль/л), мл
2,5
2,5
Перемешайте и через 10 минут измерьте оптическую плотность пробы против контрольной пробы при длине волны 540 нм, кювета с толщиной слоя 5 мм.
Активность АлАТ в опытной пробе определите по калибровочному графику в нмоль/сл.
Сравните полученный результат с физиологическими величинами и сделайте вывод. Опишите механизм работы кофермента трансаминаз.
Опыт 3. Качественная реакция на наличие фенилпировиноградной кислоты в моче.
Приборы. 1. Штатив с пробирками.
2. Набор пипеток.
3. Стеклянная воронка.
4. Фильтр.
Реактивы. 1. Моча.
2. Серная кислота, 5 н раствор.
3. Хлорид железа (III), 10%-ный раствор.
В пробирку налейте 5 мл свежепрофильтрованной мочи.
Долейте 4 капли 5 н раствора серной кислоты. Перемешайте и добавьте к смеси 4 капли 10%-ного раствора хлорида железа (III).
При наличии в моче фенилпировиноградной кислоты через 30 секунд-1 минуту появляется сине-зеленая окраска, исчезающая через 5-10 минут.
Запишите полученные результаты. В каких случаях возможно появление фенилпировиноградной кислоты в моче? Чем опасно накопление данного метаболита в тканях организма животных?
Опыт 4. Определение концентрации белка в моче.
Появление в моче белка носит название альбуминурия. Различают истинную альбуминурию, при которой почки пропускают мочу, уже содержащую белок, и случайную, когда почки выделяют нормальную мочу, но затем в нее попадают белоксодержащие примеси (кровь, гной, семя). Альбуминурия наблюдается при нефритах, расстройстве сердечной деятельности, острых инфекционных заболеваниях, иногда беременности.
Принцип метода: Метод основан на образовании тонкого кольца осадка белка при наслоении мочи на реактив Ларионовой или 50% азотную кислоту. Экспериментально установлено, что растворы, содержащие 0,033 г/л, дают мутное белое колечко между второй и третьей минутой после наслаивания.
Приборы. 1. Штатив с пробирками.
2. Набор пипеток.
Реактивы. 1. Реактив Ларионовой.
2. Моча.
3. Дистиллированная вода.
а) Качественное определение белка.
В пробирку налейте 1 мл реактива Ларионовой.
Затем осторожно, по стенке наслоите такое же количество мочи.
При наличии белка в моче появляется мутное белое колечко между 2 и 3 минутой после наслаивания.
б) Количественное определение белка.
В 5 пробирок внесите по 2 мл дистиллированной воды. В первую прилейте 2 мл мочи, перемешайте и перенесите 2 мл полученной смеси во вторую пробирку и т.д. Из пятой пробирки возьмите 2 мл смеси и отбросьте. Таким образом получают пробы мочи с разведением в 2, 4, 8, 16 и 32 раза.
В другие 5 пробирок налейте по 1 мл реактива Ларионовой. Затем осторожно, по стенке наслоите такое же количество мочи. Отметьте, в какой пробирке между 2-ой и 3-ей минутами появилось белковое кольцо.
Чтобы вычислить содержание белка в исследуемой моче, необходимо 0,033 г/л умножить на степень разведения в этой пробирке.
Запишите Ваши результаты.
Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________