Улучшение продуцентов, используемых в производстве, методами генетической инженерии

Генетическая инженерия дает возможность повышать эффективность организмов, используемых в производстве. Распространенным способом повышения выхода полезного продукта является амплификация – увеличение числа копий генов. Амплификацией генов в составе векторов получены высокоэффективные продуценты треонина и пролина.

Такие биотехнологически ценные продукты, как антибиотики, аминокислоты, витамины, характеризуются в большинстве случаев длинными и сложными путями биосинтеза, который обеспечивается десятками различных генов. Выделение этих генов и их амплификация часто трудновыполнимы. Если синтез антибиотиков идет в мультиферментных комплексах, кодируемых одним опероном, то последний может быть легко встроен в подходящий вектор и клонирован. Если гены разбросаны по всему геному, повышение выхода продукта достигается клонированием генов, соответствующих трудным местам биосинтеза.

У ряда бактерий возникает проблема не синтеза продукта, а его экскреция из клетки. Повышение эффективности транспорта продукта из клетки в культуральную жидкость ускоряет синтез новых порций продукта, например аминокислот.

Повышение эффективности традиционных методов достигается с помощью локализованного (сайт-специфического) мутагенеза in vitro: например, химическими мутагенами обрабатывают не весь геном в составе клеток, а его фрагмент с интересующим геном, полученный с помощью рестриктазы.

Биотехнолог, вооруженный методами генетической инженерии, движется от гена к продукту: вносит изменения в нуклеотидную последовательность ДНК, тем самым контролирует изменения в соответствующем белке – это составляет основу белковой инженерии. Таким способом может быть достигнута оптимизация структуры ферментов, гормонов, вакцин-антигенов.

Еще одним важным направлением генноинженерных разработок является смена питательных потребностей продуцента в целях расширения сырьевой базы промышленности и увеличение эффективности конверсии субстрата. Например, после введения соответствующих генов клетки E.coli – продуценты треонина – стали утилизировать сахарозу.

Таким образом, генетическая инженерия открывает перед биотехнологами большие перспективы, связанные как с созданием принципиально новых продуцентов ценных для человека соединений, так и с увеличением эффективности продуцентов, уже используемых в производстве.

Клеточная инженерия

Клеточная инженерия – одно из наиболее важных направлений в биотехнологии. Основой ее является гибридизация соматических клеток – слияние неполовых клеток с образованием единого целого. Слияние клеток может быть полным или клетка-реципиент может приобрести отдельные части клетки-донора: цитоплазму, митохондрии, хлоропласты, ядерный геном или его крупные блоки. Введение небольших блоков генетической информации осуществляется средствами генетической инженерии. Соматическая гибридизация имеет более широкие возможности для скрещивания филогенетически отдаленных организмов, чем половое скрещивание.

Получение гибридных клеток

Для осуществления слияния клеток между плазматическими мембранами должен установиться тесный контакт. Этому препятствует наличие поверхностного заряда на природных мембранах, обусловленного отрицательно заряженными группами белков и липидов. Для устранения этого препятствия используют переменное электрическое или магнитное поле, ионы Са²⁺ , полиэтиленгликоль и др. При слиянии животных клеток также применяют вирус Сендай, который частично гидролизует белки цитоплазматической мембраны. Так как бактериальные, грибные и растительные клетки имеют клеточную стенку, то от нее освобождаются и получают протопласты – внутреннее содержимое клетки, окруженное цитоплазматической мембраной. Клеточную стенку подвергают ферментативному гидролизу, применяя лизоцим (для бактериальных клеток), зимолиазу улитки (для клеток грибов) и комплекс целлюлаз, гемицеллюлаз и пектиназ (для клеток растений). Чтобы выделить жизнеспособные протопласты, используют осмотический стабилизатор (различные сахара или растворы некоторых солей). Кроме осмотических свойств среды должны быть подобраны рН, освещение, температура и другие факторы. После прекращения действия ферментов у протопластов начинает образовываться клеточная стенка. Протопласт, регенерировавший стенку, ведет себя как изолированная клетка, способен делиться и формировать клон клеток.

Скрининг полученных гибридных клеток проводят следующим образом:

1) проводят учет фенотипических признаков;

2) создают селективные условия, в которых выживают только гибриды, объединившие геномы родительских клеток.