Гибридизация микроорганизмов

Наиболее простой способ создания организмов с желаемым комплексом генетически обусловленных признаков – это скрещивание организмов, принадлежащих к противоположным половым типам. Однако до недавнего времени гибридизация как метод селекции в микробиологии и биотехнологии применялся чрезвычайно редко, т.к. скрещивание несвойственно миру микроорганизмов и встречается в природе как исключение, а не как закономерный способ размножения.

1. Парасексуальный цикл у грибов. В селекционной работе для гибридизации грибов используют вегетативную гибридизацию: генетический материал двух вегетативных клеток обменивается в результате клеточного слияния – парасексуального цикла. Он состоит из нескольких последовательных этапов. На первом этапе с помощью цитоплазматического мостика происходит соединение двух рядом расположенных гиф мицелия (возможно, принадлежащим к разным штаммам гриба). Через мостик происходит обмен цитоплазматического материала обеих клеток, в том числе и обмен ядрами. Ядра в гетерокарионе сливаются, образуя диплоидное ядро. Диплоидизация иногда приводит к увеличению продуктивности клеток, например, по биосинтезу органических кислот или антибиотиков. В диплоидных клетках очень часто происходит митотическое деление ядра, в результате которого могут возникать как гаплоидные, так и диплоидные рекомбинанты. Следовательно, в результате парасексуальной гибридизации достигается главная цель – образование рекомбинантного гибрида, в геноме которого объединена генетическая информация разных индивидов. Вегетативная гибридизация грибов является естественным процессом и встречается как в природе, так и в микробиологической практике. Этот метод применялся при работе с грибами таких промышленно важных родов как Aspergillus, Penicillium, Cephalosporium, Fusarium. В настоящее время разработаны методы искусственной вегетативной гибридизации, основанные на принудительном слиянии протопластов, а также на ряде приемов клеточной инженерии, позволяющих целенаправленно сливать протопласты даже генетически отделенных клеток и тем самым расширять возможности гибридизации.

2. Конъюгация у бактерий. Кроме гомологичной рекомбинации, в результате которой в хромосомах происходит обмен аналогичными генами, существуют другие формы рекомбинации генов, при которых к геному клетки добавляются новые гены. Такой тип рекомбинации генов осуществляется при помощи плазмид. Во многих случаях плазмиды включают гены, детерминирующие устойчивость клетки к тому или другому антибиотику, способность микроорганизма к образованию токсинов, а также другую наследственную информацию. Плазмида способна интегрироваться с определенной хромосомой хозяина.

Значение метода гибридизации:

- возможность объединения в одном организме (клетке) желаемых свойств двух или более штаммов или видов;

- использование рекомбинантов, отобранных среди второго поколения гибридов, с оригинальными свойствами, нехарактерными родительским клеткам;

- обогащение генома выращиваемого микроорганизма мутациями, полученными независимо у разных штаммов (это освобождает селекционера от необходимости длительного ступенчатого отбора);

- возможность переноса в клетку микроорганизма генов, нехарактерных для данного вида, а также возможность увеличения численности уже существующих генов, тем самым усиливая те свойства микроорганизма, за которые отвечает данный ген.

В настоящее время селекция микроорганизмов достигла больших успехов, обогатилась достижениями молекулярной биологии. Существует множество высокопродуктивных микроорганизмов, осуществляющих в промышленных условиях биосинтез многих ценных веществ. Однако использование методов генной инженерии значительно расширяет возможности селекции.

Генетическая инженерия

Современную биотехнологию часто характеризуют как биотехнологию на основе генетической инженерии. Генетическая инженерия – это рекомбинация in vitro, заключающаяся в конструировании организмов с заданными свойствами путем целенаправленных операций над молекулами или структурами, несущими генетическую информацию. При этом видовая принадлежность организмов не меняется, но появляются не свойственные им признаки.

Некоторые исследователи различают три уровня генетической инженерии:

1) генная – прямое манипулирование рекомбинантными ДНК, включающими отдельные гены;

2) хромосомная – манипуляции с большими группами генов или целыми хромосомами;

3) геномная – перенос всего или большей части генетического материала от одной клетки к другой (клеточная инженерия).

Однако в современном понимании генетическая инженерия представляет собой технологию рекомбинантных ДНК. Кроме того, различать хромосомную и геномную инженерию можно лишь в отношении эукариот, т.к. у прокариот понятия «хромосома» и «геном» часто совпадают.

Технология генетической инженерии состоит из следующих основных этапов:

1) получение нужного гена;

2) его встраивание в генетический элемент (вектор), способный к репликации;

3) введение гена, входящего в состав вектора, в организм-реципиент;

4) идентификация (скрининг и селекция) клеток, которые приобрели желаемый ген (гены).

Для конструирования рекомбинантных молекул ДНК необходим ряд ферментов (таблица 4).

Таблица 4

Основные ферменты генетической инженерии и их функции

Фермент	Функция
Рестриктаза	«Находит» и «разрезает» молекулы ДНК в сайтах с определенными последовательностями, которые узнает только определенная рестриктаза
РНК-зависимая ДНК-полимераза (ревертаза)	Осуществляет синтез ДНК на матрице мРНК
ДНК-полимераза	Катализирует синтез ДНК на матрице мРНК
ДНК-лигаза	«Склеивает» молекулы ДНК, образуя связи между остатками дезоксирибозофосфатами нуклеотидов
Нуклеаза	Сокращает двойную спираль ДНК с обоих концов

Важным инструментом генетической инженерии являются рестрикционные эндонуклеазы. Открытие ферментов – рестриктаз было сделано швейцарским биохимиком Вернером Арбером в 60-х г. ХХ в. В 70-х г. того же столетия была установилена способность рестриктаз разрезать ДНК только в определенных местах. Эти ферменты являются элементом системы рестрикции-модификации, предназначенной для защиты собственной ДНК клетки от включения в нее чужеродного генетического материала. Ферментативная система рестрикции и модификации ДНК была открыта в 1953 г. ХХ в. С.Луриа, Г.Бертани и Дж.Уэглом. В настоящее время системы рестрикции-модификации найдены практически у всех исследованных бактерий. Выделение большого количества рестриктаз способствовало созданию их номенклатуры:

- фермент системы обозначают буквами: первая буква – название рода, вторая и третья – первые буквы названия вида организма, из которого выделен данный фермент (например, Есо – рестриктаза выделена из Escherichia coli);

- для сокращенного обозначения рестриктаз перед названием фермента ставится буква R, а для обозначения модифицирующих метилаз – буква М (например, RЕсо и МЕсо);

- за родовидовым названием следует типовая характеристика штамма (Вsu1247);

- если один штамм содержит несколько разных систем, то ферменты этих систем обозначают римскими цифрами.