4. Идентификация клеток-реципиентов, которые приобрели желаемый ген (гены).

После трансформации, конъюгации или трансфекции необходимо идентифицировать клетки, несущие ген-мишень. Успех генноинженерного проекта зависит от эффективности использованного метода отбора, т.к. после трансплантации генов только небольшая часть клеток содержит необходимый ген. Отбор клеток проводят в две стадии.

Первая стадия: отбор клеток, несущих соответствующий вектор. Отбор проводится по генетическим маркерам, которыми помечен вектор. Например, детерминанты устойчивости к антибиотикам на векторе позволяют обогатить бактериальную популяцию клетками, содержащими этот вектор, при их высеве на среду с антибиотиком.

Вторая стадия: поиск клеток, несущих не только вектор, но и ген-мишень. Для этого используют две группы методов.

1. Методы, основанные на непосредственном анализе ДНК клеток-реципиентов:

- определение нуклеотидной последовательности ДНК: из клеток, предположительно содержащих искомый ген, выделяют ДНК вектора, в которой проводится поиск участков, несущих этот ген; затем проводят секвенирование части нуклеотидной последовательности гена;

- гибридизация выделенной из клеток ДНК с зондом, который может быть или интересующим геном, или соответствующей ему мРНК. Предварительно изолированную ДНК переводят в одноцепочечное состояние и вводят ее во взаимодействие с одноцепочечным ДНК- (или РНК-) зондом. Далее определяют присутствие двуцепочечных гибридных молекул ДНК.

2. Методы, основанные на идентификации признака, кодируемого геном:

- непосредственный отбор клеток, синтезирующих белок – продукт транскрипции и трансляции гена-мишени, или клеток, образующих соединение, в синтезе которого участвуют ферменты, кодируемые геном;

- использование селективных сред, поддерживающих рост только тех клеток, которые получили ген-мишень;

- иммунологическая детекция применяется, если искомый ген в составе рекомбинантной ДНК транскрибируется и транслируется, но никак не влияет на фенотип организма.

Генетическая инженерия и конструирование новых организмов

С помощью методов генетической инженерии можно конструировать по определенному плану новые формы микроорганизмов, способных синтезировать самые различные продукты (в т.ч. растительного и животного происхождения). Микроорганизмы обладают высокой скоростью роста и продуктивностью, способностью к утилизации разнообразных видов сырья.

Однако при конструировании новых микроорганизмов-продуцентов возникают определенные проблемы:

1. Продукты генов растительного, животного и человеческого происхождения попадают в чужую для них внутриклеточную среду, где они подвергаются разрушению протеазами. Например, пептиды типа соматостатина гидролизуются за несколько минут. Для защиты генноинженерных белков в микробной клетке применяют следующее:

- используют ингибиторы протеаз;

- получают интересующий пептид в составе гибридной белковой молекулы, для этого ген пептида сшивают с природным геном организма-реципиента;

- осуществляют амплификацию (увеличение числа копий) генов.

2. В большинстве случаев продукт трансплантированного гена не высвобождается в культуральную среду и накапливается внутри клетки, что существенно затрудняет его выделение. Например, получение инсулина с помощью E.coliпредполагает разрушение клеток и последующую очистку инсулина. Необходимо отметить, что E.coli экскретирует сравнительно мало белков. Кроме того, ее клеточная стенка содержит токсическое вещество, которое необходимо тщательно отделять от продуктов, используемых в фармакологических целях. В настоящее время более перспективными объектами генетической инженерии являются грамположительные бактерии родовBacillus, Staphylococcus, Streptomyces, а также эукариотические организмы, например дрожжи.

3. Большинство наследственных признаков кодируется несколькими генами, поэтому генноинженерная разработка должна включать стадии последовательной трансплантации каждого из генов. В некоторых случаях возможна не последовательная, а одновременная трансплантация целых блоков генов с помощью одной плазмиды.

К настоящему времени генетическая инженерия освоила все царства живого. Удобными, хорошо изученными и промышленно ценными объектами генетической инженерии являются дрожжи, представители родов Saccharomyces(винные, пекарские, пивные дрожжи),Zymomonas(для получения этанола),Candida, Pichiaи др. (для получения биомассы и микробного белка).

Основные направления развития генетической инженерии растений включают:

- обогащение культурных растений дополнительными запасными веществами с помощью генов, взятых от других растений;

- повышение эффективности фотосинтеза растений на основе генов рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы, хлорофилл a/b-связывающих белков и т.д.

- изменение азотного метаболизма;

- придание устойчивости к гербицидам, засолению почв, повышенной и пониженной температурам и др. неблагоприятным факторам внешней среды.

Однако генноинженерные манипуляции с растениями могут приводить не только к ожидаемым результатам. Например, устойчивость к гербицидам, обусловленная трансплантацией одного гена, может вызвать серьезные проблемы в севооборотах: культивируемое на определенной посевной площади устойчивое к гербицидам растение будет на следующий год выступать по отношению к сменяющей его сельскохозяйственной культуре как сорняк, против которого бессильны гербициды. Другая угроза – биохимические изменения, вызванные генетическими модификациями, могут привести к утрате растениями пищевой или кормовой ценности и даже приобретению ими токсичности. Эта проблема присуща не только генетической инженерии, но и традиционным методам селекции.

С помощью генноинженерных манипуляций с животными были клонированы гены ß-глобина мышей, тирозиновой тРНК E.coli,тимидинкиназы, ß-интерферона человека в клетках насекомых и млекопитающих.

В генетической инженерии растений, животных и человека пока не достигнуто тканеспецифического выражения генов. Иначе можно было бы лечить сахарный диабет путем введения в человеческий организм вектора с геном инсулина, который будет направлять синтез инсулина только в клетках островков Лангерганса поджелудочной железы.

Применение методов генетической инженерии в животноводстве является перспективным для изменения ряда свойств организма: повышение продуктивности, резистентности к заболеваниям, увеличение скорости роста, улучшение качества продукции и др.